水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析.pdf

1、本研究通過設計簡并引物、RT-PCR擴增并結合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1，原核表達并結合生化分析方法測定OsLOX1的酶學特性，對該基因的結構特點、表達特性進行了研究。在此基礎上，利用農桿菌介導將正義和反義OsLOX1基因導入水稻植株，探討OsLOX1在植物體內的生理功能及其與抗蟲性的關系。 研究結果如下： 1、水稻種子成熟和萌發(fā)過程中脂氧合酶同工酶活力分析利用本實驗室篩選到的LOX-3缺失突變體北

2、陸PL2和正常的水稻品種越光，研究種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性的變化規(guī)律，發(fā)現2個水稻品種在種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性變化規(guī)律基本一致，即開花后的10-25天活性持續(xù)升高，以后趨于下降，但在LOX-3缺失的品種(北陸PL2)中變化很??；在萌發(fā)初期LOX活性迅速升高，浸水萌發(fā)后2天達到峰值，然后隨萌發(fā)時間的延長而下降。同工酶分析顯示，在水稻成熟過程中種子LOX-3表達水平及活性都顯著高于其它兩種酶，而在種子萌發(fā)過程中LOX-2表達水

3、平和活性占優(yōu)勢，LOX-1則在兩種情況下都顯示較低的表達水平和活性。研究也進一步證明北陸PL2是LOX-3缺失的水稻品種。 2、水稻成熟過程種胚RNA提取方法的建立建立了一種全新、簡單的提取水稻種胚RNA的CTAB-LiCl提取法，可在不用液氮的室溫下有效地排種胚中大量帶有的多糖和本身脂質的干擾，所得RNA樣品經紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分析證明具有較高的純度和完整性，并可進一步滿足RT-PCR、Northern印跡以及cD

4、NA文庫構建的實驗需要，適用于富含多糖和脂質的植物組織RNA的提取。 3、水稻種子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析與表達規(guī)律研究根據脂氧合酶的保守序列設計簡并引物，利用RT-PCR方法，從水稻種胚中克隆了一個新的脂氧合酶基因cDNA片段。進一步用5′-RACE和3′-RACE的方法得到該基因3154bp的全長cDNA(OsLOX1，GenBank登錄號：DQ389164)。進一步克隆了OsLOX1的基因組DNA，OsLO

5、X1基因具有9個外元，8個內元。Southern分析顯示該基因在基因組中是單拷貝克隆。分析了該基因啟動子序列，發(fā)現該啟動子含有種子特異表達的順式元件和多個受傷害以及茉莉酸誘導的順式作用元件。組織表達譜分析表明，OsLOX1在未成熟胚、萌發(fā)過程中的種子及幼苗都以較低的水平表達，在正常的根、莖和葉中都不表達，而三葉期的幼苗經過傷害誘導3小時后OsLOX1表達量最高，且褐飛虱取食后其轉錄物表達量也急劇升高，至6小時達到最高值。這些結果都表明，

6、OsLOX1的表達受生物和非生物逆境脅迫誘導，參與水稻的防御反應；另外，該酶還參與水稻的生長發(fā)育過程。 4、水稻種子脂氧合酶OsLOX1在大腸桿菌中的表達與蛋白特性研究以本實驗室克隆到的水稻種子脂氧合酶OsLOX1全長cDNA為模板，用含有特異酶切位點的P1、P2為引物，通過PCR方法得到該基因的編碼框全長。將其構建到大腸桿菌表達載體pET30a(+)上，轉化進BL21(DE3)菌株，獲得含OsLOX1的重組工程菌。經過IPT

7、G誘導，水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表達產物在表達菌株中大量積累。誘導16小時后用超聲波破碎儀裂解表達菌株，裂解液用組氨酸標簽試劑盒進行純化和復性。復性后的蛋白以亞油酸為底物進行酶活測定，結果顯示，該蛋白具有明顯的脂氧合酶催化活性。利用比色法測得該酶的最適溫度為30℃及最適PH值4.8。本實驗以原核表達的方法得到、并使用組氨酸標記試劑盒純化出具有生理活性的水稻種子脂氧合酶OsLOX1，為植物種子脂氧合酶的研究提供了一種可靠的供選擇方法

8、，也為更好地研究水稻種子脂氧合酶OsLOX1的結構與功能的關系提供了良好的材料和方法。研究的結果也進一步表明本試驗所克隆的基因OsLOX1編碼的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。 5、農桿菌介導獲得轉正義和反義OsLOX1基因水稻植株及其抗蟲性鑒定利用農桿菌介導的方法，將含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的兩個雙元載體pLOX1S(35SPro.5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，pLOX1A(35SPro.

9、5’+antisene-OsLOX1cDNA+NosTer3’)，轉入粳稻栽培品種北陸PL2中，共得到46個獨立的轉基因植株。經過潮霉素篩選葉片和PCR驗證確定得到32個陽性的轉基因水稻植株，陽性率為69.6％。潮霉素篩選葉片、種子和Southern blot等檢測都表明，目的基因已經整合到水稻基因組中。RT-PCR、酶活測定的結果都表明，目的基因在轉基因水稻中有不同程度的表達。對部分轉基因植株進行褐飛虱的鑒定發(fā)現，與未轉化的對照植株相