大黃魚免疫相關(guān)基因的篩選和鑒定.pdf

1、大黃魚是我國特有的經(jīng)濟(jì)魚種，由于人工養(yǎng)殖技術(shù)的成熟使其成為目前網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的經(jīng)濟(jì)魚類，但是隨著養(yǎng)殖量的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的破壞，導(dǎo)致大面積細(xì)菌性疾病和病毒性疾病的爆發(fā)，給大黃魚的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。為了更好了解研究大黃魚的免疫系統(tǒng)為將來的大黃魚養(yǎng)殖的疾病防治提供有效支持，我們進(jìn)行如下的工作： 1.構(gòu)建了polyIC誘導(dǎo)的CDNA SMART文庫，并進(jìn)行了1039個(gè)EST隨機(jī)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了252個(gè)基因，其中包括了46個(gè)免疫相關(guān)基因

2、，這些免疫相關(guān)基因廣泛地參與了免疫應(yīng)答包括補(bǔ)體系統(tǒng)，干擾素系統(tǒng)，抗原加工提呈系統(tǒng)，免疫球蛋白等重要免疫亞系統(tǒng)，而且還首次報(bào)道了hepcidin的切割位點(diǎn)的多態(tài)性，采用半定量PCR分析幾個(gè)免疫相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)Mx protein，β2m，placenta-specific 8 genes，Cyba和CDBP2在poly IC誘導(dǎo)之后會(huì)上調(diào)表達(dá)，初步表明這些基因參與了大黃魚的免疫應(yīng)答中。 2.克隆分析γ-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體硫還原酶(GI

3、LT)基因，GILT是目前在哺乳動(dòng)物中唯一發(fā)現(xiàn)的可以在溶酶體的酸性環(huán)境中催化還原二硫鍵的硫還原酶，它催化還原二硫鍵從而幫助蛋白去折疊使之容易被溶酶體中的蛋白酶降解加工成抗原肽。大黃魚的GILT CDNA全長1033bp，編碼256個(gè)氨基酸，理論分子量為29.3KD，在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析表明，它分別與斑馬魚、人、小鼠、大鼠、狗的GILT蛋白有著54.1％，43.2％，40.0％，39.4％，and 39.2％同源性。初步序列結(jié)構(gòu)分析表

4、明所克隆到的GILT基因含有一個(gè)保守的CXXC(74～77)motif，一段gilt特征序列CQHGX2ECX2NX4C(119～134)，六個(gè)重要的半胱酸，兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。根據(jù)這些序列資料可以初步判斷所克隆到的基因是哺乳動(dòng)物GILT的同源蛋白。進(jìn)一步的基因組結(jié)構(gòu)分析表明大黃魚的GILT基因組結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的GILT基因組結(jié)構(gòu)具有一樣內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)。利用三聯(lián)細(xì)菌疫苗刺激大黃魚分析GILT的表達(dá)調(diào)控模式發(fā)現(xiàn)，GILT在三聯(lián)細(xì)菌疫苗

5、刺激之后在脾臟和。腎臟上調(diào)表達(dá)，而在肝、腦、鰓、心臟只有組成型表達(dá)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步確定了GILT參與了大黃魚的免疫應(yīng)答。通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫我們找到的pufferfish的BAC文庫中一個(gè)克隆含有GILT的全基因，繼續(xù)在這個(gè)序列分析發(fā)現(xiàn)在GILT轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游有兩個(gè)GAS位點(diǎn)(TTCNNNGAA和TCCNNNGAA)。GAS位點(diǎn)是γ-干擾素通過JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通道激活目標(biāo)基因表達(dá)的重要啟動(dòng)子，這個(gè)發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一步說明了魚類GIL

6、T基因具有與哺乳動(dòng)物中的GILT基因相似作用，也說明了γ-干擾素的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通道在魚類也是保守的。 3.克隆分析了大黃魚G-型溶菌酶基因，大黃魚G-型溶菌酶的CDNA全長716bp，編碼193個(gè)氨基酸，理論分子量21KD，在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析表明它與其他物種的G-型溶菌酶相似度為40～85％。初步的序列結(jié)構(gòu)分析表明大黃魚溶菌酶具有保守的酶催化位點(diǎn)(E71，D84，D101)和酶結(jié)合位點(diǎn)(L97，L121，L128，G1

7、52)，基因組結(jié)構(gòu)分析它具有和其他魚類的相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)，表達(dá)調(diào)控分析表明大黃魚G-型溶菌酶在小腸，心臟，肝臟，脾臟，腎臟，鰓當(dāng)中都有組成形表達(dá)，在三聯(lián)疫苗刺激之后溶菌酶在小腸，脾臟，腎臟中表達(dá)量上調(diào)8～10倍，而在其他的組織只有波動(dòng)表達(dá)，這個(gè)結(jié)果說明了G-型溶菌酶在天然免疫應(yīng)答中重要的作用。另外采用甲醇誘導(dǎo)的畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)溶菌酶，并檢測(cè)體外表達(dá)的G-溶菌酶的溶菌活力，發(fā)現(xiàn)它對(duì)革蘭氏陽性菌溶壁微球菌(M.lysodei