瘦素對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的作用.pdf

1、目的：通過(guò)軟骨細(xì)胞海藻酸鈣支架共培養(yǎng)，觀察軟骨細(xì)胞在支架材料上的生物行為。將支架植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，定期膝關(guān)節(jié)局部注射10ng/ml的瘦素，觀察、缺損處的修復(fù)狀況，進(jìn)而探討瘦素對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是否具有一定的修復(fù)作用。
　　方法：1.軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)：2只健康4周齡新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨細(xì)胞分離及擴(kuò)增、傳代。光鏡下軟骨細(xì)胞呈星形、多角形，鋪路石樣生長(zhǎng)，HE染色觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)，免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原分泌情況。2.海藻

2、酸鈉與氯化鈣混合后得到的三維支架，將傳代的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于其中。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀況，并做HE染色及免疫組化染色。3.用成年新西蘭大白兔制備兔膝關(guān)節(jié)缺損模型。4.將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：對(duì)照組：每5日經(jīng)兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1ml生理氯化鈉；支架組：經(jīng)兔膝關(guān)節(jié)缺損腔內(nèi)植入修整好的含有軟骨細(xì)胞的三維支架，并每5日注射生理氯化鈉1ml；實(shí)驗(yàn)組：三維支架植入后，每5日局部注射1ml的10ng/ml瘦素。實(shí)驗(yàn)中注意隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)個(gè)體缺損部位相同

3、，分別于術(shù)后12周處死取材，觀察缺損區(qū)軟骨生長(zhǎng)修復(fù)情況，并用HE染色、Masson染色、免疫組化染色及PCR定量分析檢驗(yàn)修復(fù)情況。以評(píng)價(jià)瘦素對(duì)三維支架植入對(duì)軟骨缺損的修復(fù)作用。
　　結(jié)果：1.分離下來(lái)的軟骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形，經(jīng)24小時(shí)后逐漸貼壁，72小時(shí)后大部分已經(jīng)貼壁。2.傳代后的軟骨細(xì)胞HE染色鏡下觀察呈三角形、多角形或梭形，細(xì)胞核明顯，呈圓形或橢圓形，HE染色顯示軟骨細(xì)胞形態(tài)良好。免疫組化染色觀察結(jié)果見細(xì)胞及基質(zhì)呈棕黃色，

4、細(xì)胞密集處顏色較深，表現(xiàn)出其特有活性。3.將混懸的軟骨細(xì)胞、海藻酸鈉、氯化鈣混合，制備出了三維支架，支架內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞未見明顯的凋亡與裂解，且細(xì)胞活性良好，HE及免疫組化檢查結(jié)果說(shuō)明三維培養(yǎng)的細(xì)胞適合植入。4.植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)后，未見明顯炎癥反應(yīng)及免疫排斥反應(yīng)，支架軟硬適宜，不會(huì)損傷關(guān)節(jié)軟骨，且后期材料降解完全，無(wú)關(guān)節(jié)殘留，表現(xiàn)出良好的組織相容性。5.植入修整后的三維支架并每日注射瘦素，促進(jìn)了Ⅱ型膠原及IGF-1的生成，對(duì)缺損處的修復(fù)有明顯促

5、進(jìn)作用。6.實(shí)驗(yàn)組：膝關(guān)節(jié)缺損處表面平整較光滑，與其他兩組相比，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGF-1分泌明顯高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組：缺損處未見明顯修復(fù)，膝關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)軟骨破壞較重，可見明顯骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)；支架組：缺損處軟骨較光滑，但低于實(shí)驗(yàn)組，膝關(guān)節(jié)未見骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。7.組織病理學(xué)檢查顯示，實(shí)驗(yàn)組纖維及瘢痕組織較少，Ⅱ型膠原染色顯示數(shù)量高于其他兩組，HE染色顯示少量成纖維細(xì)胞，核較小，排列相對(duì)規(guī)則。對(duì)照組纖維組織多，排列紊

6、亂，軟骨細(xì)胞少，核大，排列不規(guī)律。支架組軟骨細(xì)胞細(xì)胞核、成纖維細(xì)胞數(shù)量及結(jié)構(gòu)介于兩者之間。
　　結(jié)論:1.藻酸鈣支架與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞可以很好的在支架材料的表面和內(nèi)部黏附、生長(zhǎng)及增殖，細(xì)胞活性良好，未見明顯細(xì)胞毒性。2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藻酸鈣支架材料在兔體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)輕微，血管化良好，材料降解吸收緩慢，具有良好的組織相容性。3.本實(shí)驗(yàn)條件下10ng/ml的瘦素，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原及IGF-1的分泌，局部定期注射可促