北京譜系結(jié)核分枝桿菌分型和相關(guān)臨床研究.pdf

1、第一部分北京譜系結(jié)核分枝桿菌的鑒定及耐藥性分析
　　目的:初步了解我國(guó)結(jié)核病專科醫(yī)院北京譜系結(jié)核分枝桿菌感染情況及其耐藥特點(diǎn)。
　　方法:連續(xù)收集前來(lái)中國(guó)國(guó)家結(jié)核病臨床中心（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院）就診的結(jié)核病人臨床結(jié)核分枝桿菌分離菌株，藥物敏感性測(cè)定采用絕對(duì)濃度法，測(cè)定的抗結(jié)核藥物包括異煙肼(Isoniazid)、鏈霉素（Streptomycin）、乙胺丁醇（Ethambutol）、利福平（Rifampicin）、利

2、福布丁(Rifabutin)、阿米卡星(Amikacin)、卷曲霉素（Capremycin）、乙硫異煙胺(ETO)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、氧氟沙星(Ofloxaxin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、利福噴丁(Rifapentine)?？顾崛旧?、PNB和TCH鑒定。對(duì)所有收集到的，并鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株行RD105北京譜系結(jié)核分枝桿菌鑒定。
　　結(jié)果:共收集421株結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)PNB/TCH鑒定，其中413株為

3、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)菌株，8株為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。根據(jù)RD105的缺失定義北京譜系M.TB，389株M.TB缺失RD105。北京譜系M.TB所占的比例為94.2％(389/413)。單一耐藥率為82.3％(95％CI:78.5～86.2)，其中耐多藥(MDR-TB)占15％，泛耐藥(XDR-TB)占12.4％，另外，結(jié)核分枝桿菌的耐藥譜結(jié)果表明，耐藥率最高的是乙胺丁醇，達(dá)42.7％(95％CI:35.1～50.3)，其

4、次是鏈霉素41.7％(95％CI:34.0～49.4)。與中國(guó)耐藥基線調(diào)查的耐藥譜存在差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:專科醫(yī)院結(jié)核病患者感染北京譜系結(jié)核分枝桿菌的比例較高，結(jié)核病專科醫(yī)院的就診病人為高效的研究北京譜系M.TB流行特征的人群。本次研究中耐藥率最高的為乙胺丁醇，與其他地方乃至全國(guó)的耐藥情況有所區(qū)別。北京譜系M.TB可能與重癥難治性結(jié)核病存在聯(lián)系。
　　第二部分可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)聯(lián)合單核苷酸多態(tài)性(SN

5、P)對(duì)北京譜系結(jié)核分枝桿菌亞型分型的臨床意義
　　目的:探討北京譜系結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行亞型分型的臨床意義及各亞型的臨床特征。
　　方法:連續(xù)收集前來(lái)中國(guó)國(guó)家結(jié)核病臨床中心（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院）就診的結(jié)核病人臨床分離菌株，對(duì)所有北京譜系M.TB行8和51個(gè)SNP位點(diǎn)的亞型分型，以及標(biāo)準(zhǔn)的VNTR-15的基因分型。對(duì)古老和現(xiàn)代兩個(gè)亞譜系行臨床相關(guān)性分析，臨床特征包括病史（初復(fù)治）、影像學(xué)表現(xiàn)（有無(wú)空洞）、耐藥譜以及成簇率

6、。
　　結(jié)果:51位點(diǎn)將北京譜系結(jié)核分枝桿菌分為古老和現(xiàn)代兩亞型?！艾F(xiàn)代”型北京譜系M.TB，占85.5％(324/379)，“古老”北京譜系 M.TB，占14.5％(55/379)，8位點(diǎn)SNP方法分型結(jié)果與51位點(diǎn)結(jié)果一致。兩種分型方法對(duì)古老和現(xiàn)代的亞型分型相吻合。北京譜系亞型分型中，各亞型與對(duì)應(yīng)病人的臨床特征不存在聯(lián)系(P＞0.05)，現(xiàn)代與古老北京譜系M.TB相比，古老菌株的成簇率為0，而現(xiàn)代菌株的成簇率為23.8％。

7、r>　　結(jié)論:北京譜系結(jié)核分枝桿菌古老與現(xiàn)代兩亞型臨床特征之間無(wú)顯著差異?，F(xiàn)代與古老北京譜系M.TB具有不同的傳播力，現(xiàn)代型成簇率更高，傳播力更強(qiáng)?？梢酝ㄟ^(guò)結(jié)核菌分枝桿菌基因型的分析，預(yù)測(cè)結(jié)核病人治療效果和預(yù)后。
　　第三部分 SNP位點(diǎn)用于蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)
　　目的:探討北京譜系結(jié)核分枝桿菌適應(yīng)環(huán)境的分子機(jī)制，通過(guò)預(yù)測(cè)SNP野生型與突變型蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，而推測(cè)該SNP對(duì)其對(duì)應(yīng)基因所引起的功能變化。從而了解結(jié)核分枝桿菌適

8、應(yīng)環(huán)境的相關(guān)特性。
　　方法:對(duì)所有北京譜系M.TB行51個(gè)SNP位點(diǎn)的亞型分型基礎(chǔ)上，針對(duì)能夠用于分類的SNP位點(diǎn)，在PROVEAN評(píng)分的基礎(chǔ)上，選擇Rv0245(S103F)和Rv2494(V48A)行蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。利用FR-t5算法，基于目標(biāo)序列進(jìn)行了模板的篩選(template selection)和比對(duì)(alignment)。利用MODELLER(http://salilab.org/modeller/對(duì)目標(biāo)序

9、列進(jìn)行結(jié)構(gòu)模建，并利用RASP程序進(jìn)行側(cè)鏈模建優(yōu)化，得到最終的三維結(jié)構(gòu)模型。在目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上，利用CIS-RR程序?qū)ο鄳?yīng)位點(diǎn)進(jìn)行了單位點(diǎn)突變，并進(jìn)一步優(yōu)化全局側(cè)鏈，消除碰撞(eliminate clashes)。
　　結(jié)果:Rv2494可能為toxin蛋白，Rv2494(V48A)這一突變，會(huì)嚴(yán)重影響pocket區(qū)域的結(jié)合能力，進(jìn)而影響Rv2494在生理?xiàng)l件下的效率。Rv0245可能為依賴FAD或FMN的氧化還原酶。Rv