與轉(zhuǎn)錄因子AP-2α相互作用的蛋白質(zhì)的鑒定.pdf

1、AP-2α作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子AP-2家族的成員,具有組織表達(dá)特異性和DNA結(jié)合特異性.在胚胎發(fā)育,細(xì)胞分化,腫瘤發(fā)生等方面有重要作用,轉(zhuǎn)錄調(diào)控多個(gè)下游靶基因.為了闡明AP-2α確切的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式,找出與其直接相互作用的蛋白質(zhì)因子,我們以AP-2α為餌蛋白通過酵母雙雜交對(duì)HeLa細(xì)胞的cDNA文庫進(jìn)行了篩選.篩選得到兩個(gè)陽性克隆,測序后經(jīng)Blast軟件比較基因庫確定這兩個(gè)陽性克隆中所含cDNA分別為已知基因TESTIN和ACTN1的片

2、段.目前對(duì)TESTIN基因的功能研究還不多,其蛋白C端含有3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,可能是一個(gè)抑癌基因.ACTN1編碼輔肌動(dòng)蛋白1,則是公認(rèn)的與細(xì)胞骨架和細(xì)胞通訊有關(guān)的基因.將這兩段篩選所得cDNA片段和AP-2αcDNA全長及AP-2αcDNA的分段形式用GST基因融合系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),并用AP-2 α的單克隆抗體檢測了GST-AP-2α融合蛋白表達(dá)的情況.雖然所提取的融合蛋白GST-AP-2α出現(xiàn)較多降解,但是電泳遷移率變動(dòng)分析顯示其仍然具有良

3、好的DNA結(jié)合活性.所獲得的GST-TESTIN,GST-ACTN融合蛋白用于多克隆抗體的制備.用制備所得的抗GST-TESTIN血清和抗GST-ACTN血清及AP-2α的單克隆抗體分別檢測了這三種蛋白質(zhì)在HeLa細(xì)胞中的表達(dá).結(jié)果顯示三種蛋白在HeLa細(xì)胞中均有表達(dá),且AP-2α主要表達(dá)于細(xì)胞核提取物中;TESTIN大部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)提取物中,細(xì)胞核提取物中也有少量;ACTN1既表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)又表達(dá)于細(xì)胞核提取物中.AP-2α與這兩種蛋