小反芻獸疫多表位疫苗抗原的設計及其免疫效力評價.pdf

1、小反芻獸疫病毒(PPRV)屬于麻疹病毒屬（Morbillivirus），是引起山羊和綿羊等小反芻動物急性傳染病的病原，該病特點是高發(fā)病率和高死亡率，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告動物傳染病，我國將其列為Ⅰ類動物疫病。最初，PPRV僅在山羊和綿羊上有報道，但近幾年病毒種間傳播的病例被不斷出現。盡管該病毒只有一個血清型，但有四個基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，具有區(qū)域性分布的特點，目前該病主要分布于非洲和亞洲，正威脅歐洲。HN和F蛋白是

2、鑲嵌在病毒囊膜上的糖蛋白，HN蛋白能夠與淋巴細胞上的SLAM受體相互作用介導病毒入侵，這可能是導致機體免疫抑制的主要原因。在病毒侵入過程中，F蛋白能夠起到融合細胞膜和病毒囊膜的作用。另外，PPRV能引起機體強烈的細胞免疫和體液免疫應答，而HN和F蛋白則是主要的保護性抗原。本研究希望篩選出HN和F蛋白的B細胞抗原表位，進而設計小反芻獸疫多表位疫苗候選抗原。利用本實驗室構建的pET21 a-rPPRV-HN-F質粒，經過轉化、誘導表達和純化

3、獲得了rPPRV-HN-F蛋白;經過反應原性檢測，發(fā)現rPPRV-HN-F蛋白與羊源PPRV陽性血清具有明顯的反應原性，用該蛋白制備了與PPRV具有良好反應原性的單克隆抗體和多克隆抗體。同時，提取了PPRVVeroE6細胞毒培養(yǎng)基中的糖蛋白(PPRV-Glycoprotein)，制備了小鼠多克隆抗體，經過反應原性和特異性檢測發(fā)現效果良好。對China/Tib/07株和Nigeria75/1毒株HN蛋白與羊SLAM受體復合物結構進行模擬，

4、確定了相互作用的關鍵氨基酸。結合模擬的結構，利用免疫信息學工具對HN和F蛋白的B細胞表位進行了預測。將人工合成的表位肽包被在氨基化酶標板上，用間接ELISA方法檢測了表位肽與PPRV特異性抗體的反應原性，發(fā)現了一批共11條具有反應原性的表位肽。將篩選的具有反應原性的部分表位肽串聯(lián)，經過生物合成獲得了一定純度的多表位抗原。免疫小鼠檢測了抗體水平和T淋巴細胞增殖情況，發(fā)現多表位抗原能使小鼠產生特異性的抗體。流式細胞術檢測發(fā)現CD3+CD4+