THBS1在肺腺癌中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)對肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率處于首要地位的的惡性腫瘤，本研究共分以下3個部分:
　　第一部分:
　　目的:
　　THBS1在肺腺癌中的表達(dá)及其臨床病理意義
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測53例正常肺組織以及53例肺腺癌組織中THBS1蛋白的表達(dá)，并分析THBS1蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。
　　2.采用Western blotting檢測隨機(jī)選取的4例肺腺癌組織

2、和相對應(yīng)的4例正常肺組織中THBS1蛋白的表達(dá)。
　　3.采用qRT-PCR檢測隨機(jī)選取的4例肺腺癌組織和相對應(yīng)的4例正常組織中THBS1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化顯示THBS1蛋白陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，在正常肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)無表達(dá)或者表達(dá)量較低。組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.Western blotting半定量檢測示THBS1蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)高于正常肺

3、組織。
　　3.qRT-PCR檢測顯示THBS1mRNA在肺腺癌組織的水平高于正常肺組織。
　　4.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的肺腺癌組織THBS1蛋白表達(dá)高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　THBS1蛋白表達(dá)與肺腺癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑及組織學(xué)分級無關(guān)(P＞0.05)。
　　第二部分:
　　目的:
　　THBS1基因的分子克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對人肺腺癌細(xì)胞

4、株A549和H1975生物學(xué)功能的影響
　　方法:
　　1.采用實時熒光定量PCR用檢測不同肺腺癌細(xì)胞株中THBS1mRNA的表達(dá);Western blotting檢測不同肺腺癌細(xì)胞株中THBS1蛋白的表達(dá)。
　　2.從肺癌組織組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出入THBS1基因;采用HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1空載體，T4DNA連接酶連接pcDNA3.1空載

5、體片段和目的片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞。PCR鑒定正確的克隆，提取重組質(zhì)粒pcDNA-THBS1或空載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建THBS1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3-THBS1并經(jīng)酶切鑒定。
　　3.采用脂質(zhì)體2000將control siRNA(100Nm)和THBS1siRNA(100Nm)轉(zhuǎn)染THBS1表達(dá)量最高的肺腺癌A549細(xì)胞;并用脂質(zhì)體2000將真核表達(dá)載體pcDNA3-THBS1和空載體pcDNA

6、3.1導(dǎo)入THBS1表達(dá)量最低的H1975細(xì)胞。采用Western blotting和RT-PCR檢測不同組別的肺腺癌A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞中THBS1蛋白的表達(dá)。
　　4.采用新型的CCK-8試劑盒分析轉(zhuǎn)染前后不同組別的肺腺癌A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞增殖的改變。
　　5.采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同組別的肺腺癌A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化。檢測各組A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞中caspase-

7、3活性。進(jìn)一步剖析THBS1引起凋亡變化的可能的分子機(jī)制。
　　6.采用細(xì)胞劃痕實驗檢測THBS1表達(dá)變化對不同的肺腺癌A549和H1975細(xì)胞遷移的影響。
　　7.采用Western blotting技術(shù)分析不同處理組別的肺腺癌細(xì)胞中與遷移和侵襲密切相關(guān)的分子MMP-2和MMP-9的表達(dá)。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析:所有的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，二組之間的

8、比較采用t檢驗，三組及三組以上的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.肺腺癌細(xì)胞株A549、PC9和Calu3呈現(xiàn)出相對較高的THBS1mRNA的表達(dá)水平，而H1299、H358、H1975和PG49細(xì)胞呈現(xiàn)出相對較低的THBS1mRNA的表達(dá)水平。A549細(xì)胞株中THBS1蛋白表達(dá)量最高，H1975細(xì)胞株中THBS1蛋白表達(dá)量最低，在其它細(xì)胞株中均呈現(xiàn)出不同的表達(dá)量，介于A549和H1

9、975之間。
　　2.PCR擴(kuò)增得到了特異性的大小約為3500bp基因片段。PCR鑒定、酶切鑒定pcDNA-THBS1重組載體，能成功從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出500bp左右的片段，提示成功構(gòu)建了pcDNA-THBS1的真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染pcDNA-THBS1真核表達(dá)載體后，H1975細(xì)胞均能穩(wěn)定表達(dá)THBS1mRNA及蛋白。
　　3.THBS1siRNA處理的A549細(xì)胞比未處理和control siRNA處理的A549細(xì)胞中TH

10、BS1mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而未處理和control siRNA處理的A549細(xì)胞相比，THBS1mRNA和蛋白的表達(dá)無差異（P＞0.05）。與未處理的和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞相比，pcDNA3.1-THBS1組中H1975細(xì)胞中THBS1mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而未處理的H1975和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞之間相比，

11、THBS1mRNA和蛋白的表達(dá)無差異(P＞0.05)。
　　4.與未處理的A549細(xì)胞和control siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，THBS1siRNA處理的A549細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制(P＜0.05)，而未處理的A549細(xì)胞和control siRNA處理的A549細(xì)胞之間相比，A549細(xì)胞的增殖能力無差異（P＞0.05）。與未處理的和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞相比，pcDNA-THBS1組的H1975

12、細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，而未處理的和空載體pcDNA3.1處理的H1975細(xì)胞之間相比，H1975細(xì)胞的增殖能力無差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　THBS siRNA組中caspase-3活性顯著高于未處理組和control siRNA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。而pcDNA-THBS1組中caspase-3活性顯著低于未處理組和空載體pcDNA3.1組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0

13、01）。與未處理的肺腺癌A549細(xì)胞和control siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，THBS1siRNA轉(zhuǎn)染的肺腺癌A549細(xì)胞的遷移受到顯著抑制。而與未處理的肺腺癌H1975細(xì)胞和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞相比，pcDNA-THBS1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。
　　與未處理的肺腺癌A549細(xì)胞和control siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，THBS1siRNA處理的肺腺癌A549細(xì)胞中MMP

14、-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而與未處理的H1975和空載體轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞相比，pcDNA-THBS1轉(zhuǎn)染的H1975細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第三部分:
　　目的:
　　THBS1基因?qū)β闶笠浦擦錾L的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　方法:
　　1.將未處理組、control siRNA組和THBS

15、1siRNA組的肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞分別注入裸鼠皮下，然后比較各組裸鼠成瘤的大小。
　　2.采用Western blotting和qRT-PCR檢測各組裸鼠腫瘤組織中THBS1基因的mRNA表達(dá)情況。
　　3.采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測各組裸鼠腫瘤組織中THBS1、caspase3、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)情況。
　　4.統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)數(shù)

16、據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用卡方和方差分析，以P＜0.05具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1.THBS1siRNA組裸鼠移植瘤體積小于未處理組、control siRNA組裸鼠移植瘤體積，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.THBS1siRNA組裸鼠移植瘤中THBS1蛋白表達(dá)顯著低于未處理組、control siRNA組裸鼠移植瘤的表達(dá)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　

17、　3.THBS1siRNA組裸鼠移植瘤中THBS1mRNA水平顯著低于未處理組、control siRNA組裸鼠移植瘤的水平，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.THBS1siRNA組裸鼠移植瘤中caspase-3表達(dá)高于未處理組、control siRNA組裸鼠移植瘤的水平，MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)低于未處理組、control siRNA組裸鼠移植瘤的水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　

18、1.THBS1基因在肺腺癌中過表達(dá)，與肺腺癌浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3-THBS1;脂質(zhì)體2000將真核表達(dá)載體pcDNA3-THBS1或THBS1siRNA(100Nm)轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞為進(jìn)一步研究THBS1的生物學(xué)功能和靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　3.THBS1siRNA或pcDNA3-THBS1可分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞THBS1mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　4.下調(diào)THBS1可促進(jìn)肺腺癌細(xì)