FGFR3在PTH1-34促骨合成代謝中的作用及機制研究.pdf

1、骨骼是機體最大的器官，具有支撐機體、協(xié)助運動、保護內(nèi)臟器官等重要功能，并在調(diào)節(jié)機體鈣、磷、鎂等離子平衡中起關(guān)鍵作用。骨骼一直處于新陳代謝狀態(tài)，從而維持骨強度和骨完整性。骨重建過程是指成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收之間的動態(tài)平衡過程。骨穩(wěn)態(tài)一旦被破壞，將導致骨質(zhì)量和骨密度(Bone MineralDensity，BMD)的改變。如果骨吸收強于骨形成，骨骼將會發(fā)生骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)。
　　 骨質(zhì)疏松是以

2、骨量降低和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化為特征，導致骨脆性增加、骨強度降低而易骨折的一種全身系統(tǒng)性疾病，嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量和健康。隨著人口的老齡化，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為全球性的健康問題。
　　 目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括抗骨吸收類(如雌激素、降鈣素以及雙膦酸鹽等)、促骨形成類(如PTH1-34等)以及同時具有促進成骨、抑制破骨的雙功能藥物(如中藥、鍶鹽等)?？构俏疹愃庪m能抑制骨吸收、減少骨量丟失，但是骨轉(zhuǎn)換率的降低使骨微損傷得不到

3、及時清除，可能導致骨骼脆性增加。促骨合成類藥物可避免上述缺陷。甲狀旁腺激素1-34(Parathroid hormone, PTH)是迄今為止FDA 批準的治療骨質(zhì)疏松的唯一促骨合成類藥(即特里帕肽，tetroparatide)。PTH1-34 主要通過增加成骨細胞數(shù)量和活性來促進骨形成，最終使骨量增加并改善骨質(zhì)量。
　　 PTH是由甲狀旁腺主細胞分泌，主要作用于骨骼和腎臟。成熟的PTH 由84個氨基酸殘基組成，其生物活性主要決

4、定于N 端的1～34 位氨基酸序列，目前臨床上使用的是其1-34 片段，即PTH1-34。PTH1-34對骨骼的作用效果與劑量和用藥方式有關(guān)。
　　 大劑量連續(xù)PTH1-34 治療增加破骨細胞活性促進骨吸收，使骨量降低。低劑量間斷PTH1-34 處理主要增加成骨細胞活性促進骨形成，使骨量增加。研究表明間斷PTH 處理可以通過多種機制促進骨形成：(1)促進前成骨細胞分化為成骨細胞；(2)抑制脂肪細胞的生成；(3)使骨襯細胞轉(zhuǎn)化為成

5、骨細胞；(4)抑制成骨細胞的凋亡；(5)通過一些自分泌/旁分泌的分子間接發(fā)揮作用，如：TGF-β、IGF-1、Wnt、FGF等，但是其潛在的分子機制尚不完全清楚，有待進一步深入研究。
　　 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)及其受體成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)在骨骼生長發(fā)育和成年后骨穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用。

6、FGF2 敲除小鼠骨形成降低導致骨小梁骨體積減少。FGF18 敲除小鼠生長板軟骨細胞增殖帶和肥大帶增寬，長骨骨化延遲，骨橋素(osteopotin, OP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)等成骨細胞標志基因表達下降。FGF23 敲除小鼠血清鈣、磷含量和1,25(OH)2D水平升高并伴發(fā)骨質(zhì)疏松癥狀。除FGF 外，F(xiàn)GF的受體即FGFR在骨骼系統(tǒng)中的作用亦有較多研究報道。FGFR1和FGFR2 敲除小鼠胚胎期死亡，而FGFR1及

7、FGFR2的激活突變主要影響顱面部骨骼的發(fā)育，導致各種顱縫早閉綜合征，如Pfeffer 綜合征、Jackson-Weiss 綜合征、crouse 綜合征或者Apert 綜合征等。FGFR3是骨骼生長的負性調(diào)控分子，其組成激活性突變可以引起軟骨發(fā)育不全(achondroplasia,ACH)、軟骨發(fā)育不良(hypochondroplasia, HCH)以及致死性軟骨發(fā)育不全(thanatoplasiadysplasia, TD)等。而FG

8、FR3 敲除小鼠表現(xiàn)為骨骼過度生長、骨量減少、骨骼礦化障礙，但是其成骨細胞數(shù)量和活性均增加。
　　 Hurley等發(fā)現(xiàn)間斷PTH1-34 處理不能增加FGF2 敲除小鼠的BMD和骨量，并且FGF2 敲除阻斷了PTH1-34 促進成骨細胞發(fā)生、增殖、分化以及抗凋亡的作用，表明內(nèi)源性FGF2在很大程度上介導了PTH的促骨合成代謝，F(xiàn)GF2 敲除抑制了PTH 促進骨形成的作用。FGF的作用要經(jīng)其受體即FGFR 來發(fā)揮，F(xiàn)GF2 可激活

9、FGFR1、2、3、4，提示FGFR 也可能與PTH1-34的促進成骨活性有關(guān)。事實上，Hurley等發(fā)現(xiàn)PTH1-34處理可以增加FGF2、FGFR1以及FGFR2的表達。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PTH1-34 可以降低成骨細胞中FGFR3的表達。此前已發(fā)現(xiàn)FGFR3 可抑制成骨細胞的早期分化和胞外基質(zhì)合成。因此，我們推測PTH 促進骨形成與FGFR3的表達下調(diào)相關(guān)，換言之，抑制FGFR3 可能增強PTH 促進骨形成、治療骨質(zhì)疏松的功效。因此

10、，本研究我們首先考察了間斷PTH1-34 處理對FGFR3 敲除的成骨細胞活性的影響，并給于PTH1-34間斷處理FGFR3 敲除小鼠，綜合運用影像學、組織學、細胞和分子生物學手段來研究FGFR3在PTH 促進骨形成中的作用，并分析其可能的機制。
　　 我們從美國NIH 鄧初夏教授引進FGFR3+/-小鼠(C3H 背景)，通過FGFR3+/-×
　　 FGFR3+/-交配得到FGFR3 敲除(KO)及同窩野生型(WT)小

11、鼠。分離培養(yǎng)原代顱骨成骨細胞(calvariAlosteoblast cells, COBs)和骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromAlcells,BMSCs)，用10nM PTH1-34 或者Vehicle 間斷處理(WT 處理組(WT+)、WT對照組(WT-)、KO 處理組(KO+)、KO對照組(KO-))，MTT 檢測細胞增生，結(jié)果顯示KO+組細胞數(shù)量為各組中最多，WT+組細胞數(shù)量也增加；原代細胞經(jīng)過成骨誘導條件誘導及

12、間斷PTH1-34 處理后，兩種基因型的成骨細胞ALP 活性均增加，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PTH1-34處理后成骨細胞分化標志基因(Cbfa1，OC，OP)的表達在KO 成骨細胞中增加較WT成骨細胞更明顯；茜素紅染色發(fā)現(xiàn)PTH1-34 處理后KO小鼠成骨細胞礦化能力得到部分恢復。此外，TRAP 染色發(fā)現(xiàn)PTH1-34 間斷處理后，WT+和KO+小鼠破骨細胞的數(shù)量均顯著增加。定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)PTH1-34 處理后RANKL/OPG的比值在

13、KO小鼠中的增加幅度更大。上述結(jié)果提示PTH1-34 處理能夠增加WT和KO小鼠成骨細胞和破骨細胞的活性，并且FGFR3的敲除放大了PTH的促進作用。我們進一步在小鼠體內(nèi)觀察FGFR3 敲除對PTH 促進骨形成的影響。分別對2月齡和4月齡的雄性WT和KO小鼠腹腔給予PTH1-34 (80ug/kg/day)或者同等體積的生理鹽水，間斷處理28天。
　　 給藥結(jié)束后取右側(cè)股骨進行X 光攝影以及BMD 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT+和KO+小

14、鼠股骨的骨量及骨小梁BMD 明顯升高，但是在兩種基因型中增加幅度沒有顯著差別，而PTH1-34 處理后骨皮質(zhì)BMD 增加幅度在KO小鼠中明顯高于WT小鼠；我們進一步用Micro-CT對小鼠股骨進行了掃描和三維重建，股骨的縱向二維掃描圖顯示PTH能增加WT和KO小鼠骨小梁數(shù)量，骨形態(tài)參數(shù)定量分析結(jié)果顯示PTH 處理后WT和KO小鼠BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均增加，而Tb.Sp和SMI 均降低；橫斷面掃描顯示PTH 處理增加WT

15、和KO小鼠骨皮質(zhì)厚度，并且KO小鼠增加幅度明顯高于WT小鼠；
　　 脛骨HE 染色顯示PTH 處理后WT和KO小鼠骨小梁數(shù)量增多、厚度增加，并且KO小鼠脛骨骨皮質(zhì)厚度增加更顯著。TRAP 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT+和KO+小鼠TRAP 陽性信號增多，表明PTH 處理后WT和KO小鼠破骨細胞數(shù)量增加；組織定量PCR 結(jié)果顯示PTH 處理后KO小鼠成骨細胞(Cbfa1, OC, OP, COL1)和破骨細胞(MMP9, Trap)分化標志基

16、因表達與WT小鼠相比增加幅度更顯著。我們的上述實驗結(jié)果表明PTH1-34 間斷給藥能增加野生和FGFR3 敲除小鼠股骨的骨量和骨密度(BMD)，雖然KO小鼠骨小梁骨體積(BV/TV)及BMD的增加幅度與WT小鼠相比沒有顯著差異，但是骨皮質(zhì)的BMD和厚度較WT小鼠增加更顯著，提示抑制FGFR3 可增強PTH1-34 間斷給藥對骨皮質(zhì)的合成作用。
　　 綜上所述，本研究中我們發(fā)現(xiàn)PTH1-34 間斷處理能抑制成骨細胞中FGFR3的表

17、達，F(xiàn)GFR3 敲除能增強PTH1-34對成骨細胞早期分化及基質(zhì)合成的促進作用。在小鼠體內(nèi)間斷給予PTH1-34 處理的情況下，F(xiàn)GFR3 敲除小鼠骨皮質(zhì)BMD和厚度的增加幅度較WT小鼠更明顯，但其骨小梁BV/TV 以及BMD 增加幅度與野生型相比沒有顯著差別。FGFR3 敲除小鼠骨組織中成骨細胞和破骨細胞分化標志基因在PTH1-34 處理后的增加幅度均較野生型明顯。我們的研究結(jié)果提示：抑制FGFR3的表達可能有助于增強PTH的促骨合成