在體評(píng)價(jià)A20的缺失對(duì)GlcN誘導(dǎo)的血管保護(hù)的影響.pdf

1、目的：
　　本研究旨在通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)比分析A20的缺失對(duì)血管損傷后新生內(nèi)膜形成的影響，探討A20缺失對(duì)GlcN誘導(dǎo)的血管保護(hù)效應(yīng)的影響。
　　方法：
　　(1)重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增、有效性檢測(cè):
　?、儆弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法來包裝AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP，并進(jìn)一步擴(kuò)增、收集腺病毒;
　?、谂囵B(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌并傳代，用腺病毒接種大鼠主動(dòng)脈平滑肌，熒光顯微鏡下觀察效果，并提取細(xì)

2、胞蛋白，檢測(cè)A20蛋白含量，驗(yàn)證A20消減腺病毒的有效性。
　　(2)構(gòu)建大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊拉傷模型及實(shí)驗(yàn)分組:健康雄性SD大鼠，體重為350-400克，72只，隨機(jī)分為3大組，每組24只;①AD-shA20組（球囊拉傷左側(cè)頸總動(dòng)脈+轉(zhuǎn)染AD-shA20-eGFP）;②AD-NULL組(球囊拉傷左側(cè)頸總動(dòng)脈+轉(zhuǎn)染AD-NULL-eGFP);③生理鹽水組（球囊拉傷左側(cè)頸總動(dòng)脈+生理鹽水）。
　　每大組分為兩種不同的處理:Ve

3、hicle組，GlcN治療組。
　　大鼠用氯胺酮(80mg/kg)及賽拉嗪(5 mg/kg)聯(lián)合腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈的分叉處，分離左側(cè)頸外動(dòng)脈至遠(yuǎn)心端1cm，用顯微血管夾夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈，以暫時(shí)性地阻斷血流，并用手術(shù)縫線結(jié)扎頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端;在左側(cè)頸外動(dòng)脈剪一小切口，將2F Fogarty球囊導(dǎo)管沿頸外動(dòng)脈的切口插入并送至左頸總動(dòng)脈，用50微升的生理鹽水充盈

4、球囊，來回抽動(dòng)3次來剝脫頸總動(dòng)脈內(nèi)膜。退出球囊后，向頸總動(dòng)脈損傷血管的節(jié)段內(nèi)緩慢灌注相應(yīng)的灌注液AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP、生理鹽水0.5ml并浸泡血管，局部作用約30分鐘后吸出，并恢復(fù)血流。AD-shA20+GlcN治療組、AD-NULL+GlcN治療組以及生理鹽水+GlcN治療組術(shù)后即刻給予GlcN（0.3mg·g-1·day-1ip），連續(xù)注射14d。
　　(3)術(shù)后第5天取每組大鼠3只，取出左側(cè)頸

5、總動(dòng)脈損傷節(jié)段，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的含量，藉以評(píng)估AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP的轉(zhuǎn)染效率。
　　(4)術(shù)后第14天取各組左側(cè)損傷的頸總動(dòng)脈以及右側(cè)作為對(duì)照，做石蠟切片進(jìn)行HE染色，進(jìn)行內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)分析;
　　(5)用WB法檢測(cè)左側(cè)球囊損傷血管壁組織的A20，P-P65，O-GlcN的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)在轉(zhuǎn)染AD-shA20的RASMCs，A20蛋白

6、表達(dá)明顯減少，表明AD-shA20-eGFP具有消減A20的作用，包裝的腺病毒有效。
　　(2)熒光顯微鏡下觀察冰凍切片，可以見到血管內(nèi)膜及中膜有大量綠色熒光分布，證明球囊拉傷血管AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP轉(zhuǎn)染成功。
　　(3)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后14d，各組大鼠的左側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜跟右側(cè)未拉傷的血管相比，內(nèi)膜均有不同程度的增生，證明球囊拉傷手術(shù)成功。AD-NULL組和生理鹽水組，增加機(jī)體的O-Gl

7、cNAc修飾水平后，新生內(nèi)膜的增生明顯受到抑制;AD-shA20組，增加體內(nèi)的O-GlcNAc修飾水平，對(duì)新生內(nèi)膜的增生的抑制作用明顯減弱;且AD-shA20組在不增加O-GlcNAc修飾水平的情況下，新生內(nèi)膜增生的情況比其他組更顯著。
　　(4)各組的GlcN處理后，O-GlcNAc修飾水平均明顯提高，各組A20表達(dá)略微升高;AD-NULL組和生理鹽水組提高O-GlcNAc修飾的水平可以抑顯著制P-P65的表達(dá);AD-shA20

8、組，A20蛋白的表達(dá)明顯降低，且提高O-GlcNAc修飾水平不能再明顯抑制P-P65的表達(dá);AD-shA20組在不升高O-GlcNAc修飾水平的情況下（Vehicle處理），與其他組相比，P-P65的表達(dá)顯著升高。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后局部轉(zhuǎn)染AD-shA20可以降低局部組織A20的表達(dá)。
　　2.提高機(jī)體的O-GlcNAc修飾水平，對(duì)球囊拉傷后血管新生內(nèi)膜的增生有抑制作用。
　　3.A20的