Avastin對肺癌誘導(dǎo)的微血管生成影響.pdf

1、一、研究背景與目的 肺癌與其它實體瘤一樣，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成。以新生血管為靶點，抑制腫瘤血管生成、阻斷腫瘤的營養(yǎng)來源和遷移通道，這已成為近年來癌癥治療的新策略。本研究擬建立一種模擬體內(nèi)環(huán)境的肺微血管內(nèi)皮細胞(LMVEC)生長的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體Avastin對肺癌誘導(dǎo)的肺微血管生成的影響效應(yīng)，并探討其作用機制。研究反應(yīng)停、Avastin對A549細胞裸鼠皮下腫瘤血管生成的影

2、響。 二、材料和方法 (一)材料 低糖型DMEM干粉和胎牛血清(FBS)均購自Hyclone，6孔細胞培養(yǎng)板為Costar產(chǎn)品；胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EGF、地塞米松、內(nèi)皮細胞生長添加物(ECGS)、PEG20000、碘丙啶(PI)、RNA酶(Rnase)、TNP-470、結(jié)晶紫和多聚甲醛均為SIGMA公司產(chǎn)品；鼠抗人CD31單克隆抗體、鼠IgG和TRITC標記兔抗鼠二抗均購自北京中杉金橋公司。濾膜和MW10000透

3、析膜為Millipore產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱、Nikon倒置相差顯微鏡及相機、eppendorf5810R型離心機、LXY-Ⅱ型離心機、微量加樣器、熒光顯微鏡、電子分析天平、超凈工作臺、眼科剪刀、鑷子。 (二)試驗方法 1.肺組織的取材、處理和內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及其鑒定。 2.顯微鏡下觀察培養(yǎng)過程中LMVEC的形態(tài)學(xué)變化并拍照。 3.培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，并提取上清液，誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細胞生成。

4、4.制備鼠尾膠及血管內(nèi)皮三維培養(yǎng)模型的建立，并用解剖顯微鏡觀察，游標卡尺測量無血管結(jié)構(gòu)區(qū)域直徑(D，cm)。根據(jù)S=πD2/4計算抑制血管生成面積(S，cm2)。 5.Avastin對LMVEC的細胞周期和凋亡的影響，流式細胞儀測定細胞周期，細胞凋亡的檢測采用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒。 6.建立肺腺癌的裸鼠模型，研究反應(yīng)停、Avastin對A549細胞裸鼠皮下腫瘤血管生成的影響。 7.統(tǒng)計學(xué)處

5、理：采用SPSS10.0軟件。 三、結(jié)果： 1.LMVEC細胞培養(yǎng)和鑒定。平面培養(yǎng)的LMVEC呈梭形貼壁生長，3～5天即可傳代；三維培養(yǎng)的LMVEC呈鋪路石形態(tài)，經(jīng)過肺癌條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)以后出現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色結(jié)果表明，CD31主要定位于LMVEC胞膜和胞漿。 2.Avastin對肺癌誘導(dǎo)的LMVEC血管生成的抑制作用。隨著Avastin作用濃度增加，無血管結(jié)構(gòu)區(qū)域的面積亦增加，25μg/ml組的0.944

6、±0.073cm2增加為100μg/ml組的5.189±0.192cm2(P＜0.001)，表明Avastin的作用具有劑量依賴效應(yīng)。 3.Avastin對LMVEC細胞周期影響。細胞周期研究表明，對照組G0/1、S和G2/M期組成分別為59.9±2.5％、21.2±1.2％和18.9±0.5％，而經(jīng)Avastin處理后變化為77.1±3.5％、11.5±0.5％和11.4±0.3％(P＜0.05)，表明Avastin阻滯LMV

7、EC于G0/1期邊界，造成細胞周期停滯，同時引起S期和G2/M期細胞比例顯著降低。 4.Avastin對LMVEC細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。凋亡研究表明，Avastin對LMVEC具有較強的凋亡誘導(dǎo)作用，隨著Avastin作用濃度增加，LMVEC凋亡率亦增加。由25μg/ml組的31.3±1.2％增加為100μg/ml組的39.7±1.1％(P＜0.001)，表明Avastin的凋亡誘導(dǎo)作用具有劑量依賴效應(yīng)。對照組、Avastin(5

8、0μg/ml)的凋亡率分別為1.3±0.3％、34.5±1.8％。 5.從裸鼠抑瘤實驗的結(jié)果可見，給藥后可以降低腫瘤組織的微血管密度，并顯示出抑制腫瘤生長的趨勢，其中聯(lián)用組更明顯。反應(yīng)停組、Avastin組、反應(yīng)停+Avastin組的抑瘤率分別為9.44％、12.10％、18.06％，說明在實體瘤的治療方面，反應(yīng)停及Avastin對裸鼠移植瘤的生長均有抑制作用，且它們有協(xié)同抗腫瘤作用。 四、結(jié)論： 1.經(jīng)鼠抗人C

9、D31單克隆抗體鑒定以及細胞形態(tài)學(xué)的特點，成功培養(yǎng)出LMVEC的細胞模型。 2.本研究建立一種LVEC三維培養(yǎng)模型，藥物作用研究表明，Avastin能夠抑制肺癌誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮形成血管樣結(jié)構(gòu)，這種抑制作用與Avastin介導(dǎo)的細胞周期阻滯和調(diào)亡誘導(dǎo)作用密切相關(guān)。 3.Avastin可明顯抑制肺癌誘導(dǎo)的肺微血管生成。 4.在實體瘤的治療方面，反應(yīng)停及Avastin對裸鼠移植瘤的生長均有抑制作用，且它們有協(xié)同抗腫瘤