骨橋蛋白的原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是細(xì)胞外基質(zhì)中一種重要的功能性蛋白，可由多種組織細(xì)胞合成與分泌。近年來的研究表明，OPN作為機(jī)體反應(yīng)性蛋白，在機(jī)體炎癥、組織損傷與修復(fù)等病理過程中具有重要的功能和作用。在心血管系統(tǒng)中，OPN 通過與血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞(VSMC)表面的整合素受體相互作用而介導(dǎo)細(xì)胞黏附和遷移，進(jìn)而參與血管內(nèi)皮損傷所導(dǎo)致的內(nèi)膜增生的發(fā)生與發(fā)展過程。為了研究OPN誘導(dǎo)VSMC黏附和遷移的分子機(jī)制及其在血管內(nèi)膜增

2、生中的作用，制備OPN是必要的。為此，本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，將OPN cDNA與攜帶GST 編碼序列的原核表達(dá)載體進(jìn)行重組后，在大腸桿菌中表達(dá)得到GST-OPN融合蛋白，為進(jìn)一步研究該蛋白在血管內(nèi)膜增生中的作用奠定了基礎(chǔ)。 方法： 1、OPN原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將OPN cDNA片段克隆入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，構(gòu)建pGEX-4T-1-OPN質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜和DNA序列分析對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒

3、定。 2、GST-OPN融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 2.1 GST-OPN融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pGEX-4T-1-OPN轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，對IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行篩選優(yōu)化，確定GST-OPN融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。在最佳條件下對pGEX-4T-1-OPN轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將菌體裂解后離心，分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢查融合蛋白在細(xì)胞中的存在形式。 2．2 GST

4、-OPN融合蛋白的分離純化 菌體經(jīng)裂解及離心后取上清，用GST-Sepharose 4B親和層析對GST-OPN融合蛋白進(jìn)行純化。 3、GST-OPN融合蛋白生物學(xué)活性檢測 3．1細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將傳代的VSMC接種到用OPN包被的96孔板中，檢測單位時(shí)間內(nèi)黏附至孔板上的細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞黏附活性。以從VSMC培養(yǎng)基中提取的天然OPN和GST蛋白作為平行對照，以確定GST-OPN促進(jìn)細(xì)胞黏附的特異

5、性。 3．2傷口愈合實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞傳代時(shí)，將VSMC接種于帶有玻片的孔板內(nèi)，細(xì)胞生長至100％匯合后，用無菌吸頭在玻片上劃痕。PBS洗凈刮下的細(xì)胞，將玻片放回孔板內(nèi)，每孔加入23 mg/LGST-OPN，繼續(xù)孵育24 h后，于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合程度，以此表示細(xì)胞的遷移活性。以從VSMC培養(yǎng)基中提取的天然OPN和GST蛋白作為平行對照，以確定GST-OPN促進(jìn)細(xì)胞遷移的特異性。 結(jié)果： 1、重組質(zhì)

6、粒pGEX-4T-1-OPN的構(gòu)建 以含有OPN cDNA序列的重組質(zhì)粒OP10(DrLarryFisher惠贈(zèng))為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的OPN cDNA片段與pGEX-4T-1載體連接得到重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Bam H I/Xho I雙酶切后進(jìn)行電泳鑒定時(shí)出現(xiàn)長度為860 bp左右的插入片段，與預(yù)期結(jié)果相一致。測序分析結(jié)果與GeneBank 收錄的OPN cDNA序列進(jìn)行比對，證明插入片段的序列是正確的。

7、2、GST-OPN融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)分子量約75 kD的蛋白質(zhì)。在培養(yǎng)物OD<,600>=1.5時(shí)按1：50的比例接種于含0.1 mmol/IPTG的LB培養(yǎng)液中，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h的條件下， GST-OPN融合蛋白的表達(dá)量在菌體蛋白中所占比例最大，融合蛋白主要以可溶性形式存在。此條件作為GST-OPN 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。 3、GST-OPN融

8、合蛋白的分離純化 轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌在最佳條件下被誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌體，用PBS(pH 7.3)重懸后加NaOH調(diào)pH值為8.0，以達(dá)到溶菌酶發(fā)揮作用的最適pH，用溶菌酶室溫消化后加Triton X-100以防止蛋白交聯(lián)。離心收集上清，加谷胱甘肽瓊脂糖珠共孵育，經(jīng)PBS洗滌4-5次后，用還原型谷胱甘肽洗脫液進(jìn)行數(shù)次洗脫，合并收集的洗脫液。取適量洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果可見清晰的單一的75 kD蛋

9、白條帶，說明經(jīng)親和層析純化的GST-OPN 已達(dá)電泳純。100 ml培養(yǎng)物經(jīng)親和層析純化后，得到約3 mg可溶性GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白對VSMC黏附的影響 本研究觀察重組GST-OPN融合蛋白對細(xì)胞黏附的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GST-OPN融合蛋白能夠顯著促進(jìn)VSMC的黏附，其作用與天然OPN相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。平行對照中的GST蛋白不影響VSMC的黏附。 5、GST-OPN融合蛋白

10、對VSMC遷移的影響 VSMC遷移是由細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子相互作用所介導(dǎo)的。細(xì)胞外基質(zhì)中的OPN作為整合素的主要配體在VSMC遷移中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究重組OPN對細(xì)胞遷移的影響，與黏附實(shí)驗(yàn)分組相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GST-OPN可明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移，其作用與天然OPN 相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，平行對照實(shí)驗(yàn)中的GST蛋白對VSMC的遷移沒有影響。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了含有OPN基因序列的pGEX-4T-

11、1-OPN原核表達(dá)質(zhì)粒。 2、經(jīng)過對IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，25℃條件下用0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，GST-OPN融合蛋白在大腸桿菌中得到有效表達(dá)。 3、菌體經(jīng)裂解及離心后取上清，經(jīng)GST-Sepharose 4B親和層析得到電泳純的GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白能顯著促進(jìn)VSMC黏附。 5、GST-OPN融合蛋白能顯著促進(jìn)VSMC遷移