Ochrobactrum L-3的L-肉堿脫氫酶研究.pdf

1、L-肉毒堿(L-Camitine,CN)又叫L-肉堿、維生素BT、左卡尼汀,化學(xué)名稱為L-β-羥基-γ-三甲胺丁酸。L-肉堿是一種基本的細胞成分。主要位于線粒體內(nèi)膜上,是長鏈脂肪酸進入線粒體的運輸載體。自從1973年Engel報告第一例人類CN缺乏癥(CD)以來,有關(guān)L-肉堿的生理生化,CD的病理和臨床報告日漸增多,成為臨床醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的一個重要課題。L-肉堿作為藥物治療由CD引起的各種疾病取得了很好的效果,其生產(chǎn)方法的改進和創(chuàng)新對于L

2、-肉堿的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。目前生產(chǎn)L-肉堿的方法中,酶轉(zhuǎn)化法具有環(huán)境友好、成本低、產(chǎn)品安全性高等特點,是較有吸引力的方法。 在酶轉(zhuǎn)化法中,L-肉堿脫氫酶(EC 1.1.1.108)是所需要的一個重要的酶,因此它的性質(zhì)對該方法的使用和推廣非常重要。雖然已有少量文獻對此類酶進行了報道,但在這些已報道的酶中,大多數(shù)都存在著酶活和專一性不高的問題。 本研究從土壤中分離篩選到一株產(chǎn)L-肉堿脫氫酶菌株L-3,對其進行了系統(tǒng)

3、地分類學(xué)鑒定,并研究了該菌株產(chǎn)L-肉堿脫氫酶的發(fā)酵條件,進行了該酶的純化和對酶性質(zhì)研究。主要實驗結(jié)果如下： 1.菌株的篩選分離及鑒定經(jīng)過富集培養(yǎng)劃線分離純化后,得到了一株能夠生產(chǎn)L-肉堿脫氫酶的菌株,通過對該菌株的形態(tài)學(xué)研究,生理生化測定,16SrDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析,確定菌株L-3屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp)。 2、菌株產(chǎn)酶發(fā)酵研究對菌株L-3產(chǎn)酶發(fā)酵的條件進行了研究。研究采用搖瓶培養(yǎng)試驗,

4、以測定菌體生長量、酶活性為指標(biāo),確定了該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳條件為,培養(yǎng)基組成：0.5％L-肉堿,0.2％葡萄糖,0.2％K2HPO4.3H2O,0.05％KH2PO4,0.05％MgSO4·7H2O,1.0％(v/v)微量元素(包括5.2％ZnSO4,5.0％FeSO4·7H2O,5.0％CuSO4·7H2O和0.05％MnSO4·H2O),pH 6.5。培養(yǎng)溫度30℃,裝液量為100 mL三角瓶裝20 mL培養(yǎng)基,于120 rpm轉(zhuǎn)速

5、下培養(yǎng)24 h。在上述培養(yǎng)條件下發(fā)酵,發(fā)酵液的酶活可達1.46U/ml。 3.酶的純化和性質(zhì)研究在發(fā)酵罐中培養(yǎng)10L菌液,離心收集,沉淀經(jīng)超聲波破壁后得到粗酶液。粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE-Cellullose離子交換層析、Toyopearl HW-65C疏水層析、Sephadex G-75分子篩層析后,純度提高約51倍,比活達到2.55U/mg。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示為單一條帶,分子量約為57kD。