穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿調(diào)控腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過體外培養(yǎng)人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞和建立裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合用藥成為腎母細(xì)胞瘤的一個(gè)新化療方案提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法:將人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞株保存于含15％熱滅活胎牛血清的Maccyo'5培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、100％濕度的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

2、SK-NEP-1細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行處理，對(duì)照組為將以上各濃度實(shí)驗(yàn)組相同量的DMSO加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。處理時(shí)間按實(shí)驗(yàn)需要分別設(shè)置為24、48和72小時(shí)。
　　2.細(xì)胞增殖檢測(cè):使用Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。使用GraphPad Prism6.0軟件計(jì)算一系列的劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得單獨(dú)使用或與AND聯(lián)合應(yīng)用時(shí)VCR的半數(shù)抑制濃度(IC50)。采用CompuSyn軟件進(jìn)行聯(lián)合用藥分析

3、，生成不同濃度的VCR和AND組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù)(CI)，其中可加性、協(xié)同性和拮抗性分別由0.9-1.1，＜0.9和＞1.1的數(shù)值反映。
　　3.細(xì)胞凋亡及Caspase-3（半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶）活性檢測(cè):應(yīng)用AnnexinⅤ/PI雙染色法對(duì)各組凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色并采用FACScan流式細(xì)胞儀分析。采用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3的活性。
　　4.細(xì)胞自噬檢測(cè):使用單丹磺酰尸胺染色（MDC法

4、）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，采用配備過濾系統(tǒng)的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察自體吞噬泡并計(jì)數(shù)和拍照。采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)檢查有無自噬體。
　　5.蛋白印跡法（Western blotting）檢測(cè)ERK、p-ERK、p53、p-p53、AKT、p-AKT等細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平。
　　6.裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn):使用BALB/c裸鼠建立SK-NEP-1皮下移植腫瘤模型，購(gòu)買裸鼠45只，建立模型成功32只。裸鼠模型建立后隨機(jī)分入四組:對(duì)照組

5、（生理鹽水，口服，每日一次）、100mg/kg的AND治療組（口服，每日一次）、0.2mg/kg的VCR治療組（腹腔注射，每周一次）、VCR和AND聯(lián)合治療組，每組8只，連續(xù)給藥4周。每周測(cè)量一次腫瘤體積和裸鼠體重。4周后處死裸鼠，解剖裸鼠剝離原位瘤后測(cè)量瘤重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(％)=（對(duì)照組瘤重—治療組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100％。移植瘤切片后進(jìn)行TUNEL凋亡檢測(cè)及免疫組化分析。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)

6、軟件分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多樣本兩組之間的比較采用單因素方差分析，取P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞具有協(xié)同抑制增殖作用:SK-NEP-1細(xì)胞按對(duì)照組、VCR(0-15nM)組和AND（0-25μM）組分別處理24、48、72小時(shí)，CCK-8法分析各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。結(jié)果顯示長(zhǎng)春新堿的濃度越大、處理時(shí)間越長(zhǎng)，SK-NEP-1細(xì)胞的

7、生長(zhǎng)抑制率越高。而不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯組SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均較低。另外CCK-8法分析結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用時(shí)SK-NEP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于VCR組。使用GraphPad Prism6.0軟件計(jì)算出VCR的IC50為10.8nM，聯(lián)合應(yīng)用l0μM、20μM、25μM AND時(shí)VCR的IC50分別為9.5nM、6.6nM、5.1nM，VCR+20μM AND聯(lián)合應(yīng)用組與VCR組之間、VCR+25μM AN

8、D聯(lián)合應(yīng)用組與VCR組之間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。采用CompuSyn軟件進(jìn)行聯(lián)合用藥分析，生成10.8nMVCR分別與10μM、20μM、25μM AND組合時(shí)的聯(lián)合指數(shù)，結(jié)果分別為0.98、0.66、0.58，提示穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿具有協(xié)同性。SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8nM VCR組、10.8nM VCR+10μM AND組、10.8nM VCR+20μM AND組、10.8nM VCR+25μM

9、AND組處理48小時(shí)后，采用倒置顯微鏡觀察顯示在穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合使用組可見到細(xì)胞數(shù)量明顯減少以及細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　2.穿心蓮內(nèi)酯促進(jìn)了長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞凋亡，Caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡參與這個(gè)過程:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8nM VCR組、10.8nM VCR+10μM AND組、10.8nM VCR+20μM AND組、10.8nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí)，使用A

10、nnexinⅤ/PI雙染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示對(duì)照組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)僅占5％，10.8nM VCR組凋亡的細(xì)胞數(shù)為32％，而10.8nM VCR加用10、20和25μM的AND后顯著提高了SK-NEP-1細(xì)胞的凋亡率，相應(yīng)的數(shù)值分別為39％、50％和56％。10.8nM VCR+20μM AND組、10.8nM VCR+25μM AND組分別與VCR組相比，兩者間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Caspa

11、se-3活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)了五組中Caspase-3底物分裂的比值用以分析Caspase-3的活性。10.8nM VCR+20μM AND組和10.8nMVCR+25μM AND組的Caspase-3的活性高于VCR組，兩者分別與VCR組之間的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.細(xì)胞自噬沒有參與穿心蓮內(nèi)酯和（或）長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞死亡過程:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、10.8nM VCR組、1

12、0.8nM VCR+10μMAND組、10.8nM VCR+20μM AND組、10.8nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí)，使用MDC法進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察各組中自體吞噬泡的情況。結(jié)果顯示各組之間無明顯差別，MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均不超過5％。透射電子顯微鏡觀察顯示各組細(xì)胞內(nèi)并無明顯的自噬體結(jié)構(gòu)形成。
　　4.穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用上調(diào)了p-p53的蛋白表達(dá)水平并下調(diào)了p-AKT的表達(dá)水平:SK-NEP-1細(xì)胞分

13、別按對(duì)照組、10.8nM VCR組、10.8nMVCR+10μM AND組、10.8nM VCR+20μM AND組、10.8nM VCR+25μM AND組處理48小時(shí)，采用Western blotting分析了五組中p-p53、p-AKT、p-ERK的表達(dá)水平。結(jié)果表明p-p53在五組中的表達(dá)水平逐漸升高，p-AKT的表達(dá)水平逐漸下降，而p-ERK的表達(dá)水平無明顯變化。具體數(shù)據(jù)顯示p-p53的表達(dá)水平在10.8nM VCR+20μM

14、 AND處理組中最高。
　　5.AKT活化劑抑制了穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的SK-NEP-1細(xì)胞凋亡:SK-NEP-1細(xì)胞分別按對(duì)照組、VCR組、VCR+AND組、VCR+SC-79預(yù)處理組、VCR+AND+SC-79預(yù)處理組處理48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。CCK-8法分別檢測(cè)了五組中細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果顯示VCR+AND組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于VCR+AND+SC-79預(yù)處理組，兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而VCR組

15、與VCR+SC-79預(yù)處理組間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blotting分析了五組中細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AKT活化劑SC-79抑制了穿心蓮內(nèi)酯和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合應(yīng)用時(shí)p-AKT和p-p53的表達(dá)水平變化。
　　6.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿顯著抑制了裸鼠皮下移植腫瘤的生長(zhǎng):裸鼠皮下移植腫瘤模型按實(shí)驗(yàn)分組治療4周，結(jié)果顯示在腫瘤體積及重量方面，VCR+AND組均低于對(duì)照組及VCR組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

16、0.05);VCR組亦低于對(duì)照組，兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而AND組與對(duì)照組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。移植瘤TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果提示AND和VCR聯(lián)合治療組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，與對(duì)照組和VCR組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，AND組與對(duì)照組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植瘤免疫組化分析結(jié)果提示AND和VCR聯(lián)合治療組p-p53蛋白的表達(dá)水平最高，而p-AKT蛋白的表達(dá)水平最低，與對(duì)照組及VCR組

17、相比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿有效抑制了體外人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞和體內(nèi)SK-NEP-1細(xì)胞移植腫瘤的生長(zhǎng)。穿心蓮內(nèi)酯自身對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞并沒有顯著的生長(zhǎng)抑制效果，但它增加了SK-NEP-1細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。
　　2.穿心蓮內(nèi)酯聯(lián)合長(zhǎng)春新堿通過P13K-AKT-p53信號(hào)通路誘導(dǎo)SK-NEP-1細(xì)胞的凋亡。
　　3.Caspase-3依