PET-MR結(jié)合免疫熒光定位研究移植MSCs在犬退變椎間盤中的轉(zhuǎn)歸.pdf

1、椎間盤退變(IVDD)已經(jīng)成為了當(dāng)代人類的主要健康問題之一。盡管骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)已經(jīng)被實驗性用于治療椎間盤退變，但是植入的MSCs具體轉(zhuǎn)歸尚不明確，治療效果也有爭議。在缺乏無創(chuàng)和連續(xù)實時的方法來研究在體MSCs存活時間和分化機制的情況下，MSCs治療IVDD的效果很難有所突破。為實現(xiàn)這一目的，本研究使用外科手術(shù)造模的方法來制作IVDD的動物模型，在其椎間盤中植入聯(lián)合轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)和HSV1-sr39tk[單純皰疹

2、病毒Ⅰ型胸苷激酶（herpes simplex virus type1thymidine kinase）的突變型，較野生型HSV1-tk免疫原性更低，敏感性更高]并且標(biāo)記氧化磁納米鐵顆粒(MION)的MSCs;同時使用PET-MR連續(xù)示蹤與組織免疫熒光雙相定位相結(jié)合的方法，研究MSCs在椎間盤退變病灶中的存活與分化機制，為椎間盤退變的干細胞治療提供基礎(chǔ)科學(xué)支持。
　　本研究包含3個部分:第一部分:犬椎間盤退變動物模型的建立;第二部

3、分:HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染和MION共標(biāo)記MSCs;第三部分:共標(biāo)記MSCs植入退變椎間盤后的轉(zhuǎn)歸，MSCs轉(zhuǎn)歸與退變椎間盤修復(fù)機制的關(guān)聯(lián)。
　　研究目的:
　?。ㄒ唬炞C通過外科手術(shù)的方法經(jīng)腹膜后入路切開纖維環(huán)和有限破壞髓核，能否建立穩(wěn)定的犬椎間盤退變動物模型。
　?。ǘ╅_發(fā)和驗證HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染并以MION共標(biāo)記MSCs能否作為一種工具細胞系，用于PET-MR聯(lián)合分子影像示蹤和組

4、織免疫熒光定位雙相成像以開展MSCs存活和功能分化的研究。
　　（三）確認植入退變椎間盤的MSCs是否可被PET-MR一期連續(xù)活體成像所示蹤并判斷存活時間;MSCs植入轉(zhuǎn)歸與椎間盤退變修復(fù)的相關(guān)程度;植入MSCs分化為何種絀胞及其功能性。
　　研究方法:
　?。ㄒ唬﹨⒖既慕馄侍攸c，采用左外側(cè)腹膜后入路，暴露切開L2～L5的前外側(cè)纖維環(huán)，切開纖維環(huán)后使用咬合口徑為1mm的髓核鉗部分髓核[預(yù)實驗已經(jīng)確認采用此類髓核鉗咬除

5、一次髓核的量大約為（13.7±3.5）mg，約為總體積的10％]，縫合纖維環(huán)后逐層關(guān)腹。所有27只動物被隨機分為3組:(1)sr39tk組:椎間盤中移植HSV1-sr39tk轉(zhuǎn)染的MSCs;(2)MION組:MION標(biāo)記的MSCs植入椎間盤;(3)sr39tk+MION組:椎間盤中植入HSV1-sr39tk轉(zhuǎn)染和MION共標(biāo)記的MSCs。以上3組被定義為實驗組，植入MSCs均標(biāo)記GFP。在每組動物的L2～L3和L3～L4椎間盤中植入細胞

6、。每只動物中L1～L2作為陽性對照，L4～L5作為陰性對照。術(shù)后以磁共振、大體和HE染色確認椎間盤退變模型是否制作成功。
　?。ǘ?1)以密度梯度離心+差速貼壁法分離培養(yǎng)MSCs;(2)使用LIPOFECTAMINE2000試劑轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒進入MSCs，進行熒光鑒定;(3)在培養(yǎng)基中加入濃度為20mg/mL的MION，給予MION標(biāo)記，最后進行普魯士藍染色確認和標(biāo)記效率測定。(4)HSV1-sr39tk的構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染:選擇p

7、LVX-DsRed-Monomer-N1載體，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中HSV1-tk基因序列以及文獻報道的HSV-sr39tk突變位點，得到HSV-sr39tk基因序列全長。根據(jù)載體信息選擇酶切位點為上游XhoI、下游KpnI。合成含有酶切位點的目的基因序列，測序鑒定后予HSV1-sr39tk重組慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染MSCs。(5)確定HSV1-sr39tk和GFP轉(zhuǎn)染、MION共標(biāo)記后骨髓MSCs增殖能力、代謝能力和表型變化。
　　（三

8、）(1)在X線正側(cè)位確認和動物麻醉狀態(tài)下，將MSCs(1×106/mL)隨機經(jīng)皮注射進入L2～L4椎間盤。檢查時間點是細胞植入后第3天、第2周、第3周和第4周，每個檢查時間點在每組細胞選擇18個椎間盤數(shù)據(jù)以供統(tǒng)計分析。(2)所有動物行磁共振檢測由MION產(chǎn)生的低信號，信號減低程度以水平面正常椎間盤區(qū)和該區(qū)的信號強度之差與正常椎間盤信號強度的百分比表示。
　　研究結(jié)果:
　?。ㄒ唬┰谡麄€試驗周期，所有動物保持健康。造模手術(shù)后6

9、周，MR檢查顯示所有實驗動物的L2～L5椎間盤均表現(xiàn)為髓核的不均質(zhì)化、組織丟失和邊界不清。Pfirrmann分級保持在4～5級(4.26±0.24)，呈現(xiàn)出經(jīng)典的椎間盤退變表現(xiàn)。大體標(biāo)本顯示髓核出現(xiàn)的空洞、破裂和不均質(zhì)化，纖維環(huán)失去完整性并后突，椎間隙高度丟失且不對稱。HE染色顯示髓核中脊索細胞減少，髓核裂隙形成，髓核纖維環(huán)分界不清，纖維環(huán)排列紊亂，提示手術(shù)造模成功。
　?。ǘ?1)原代骨髓單核細胞經(jīng)過密度梯度離心和差速貼壁法培

10、養(yǎng)后3周左右，可穩(wěn)定篩選出MSCs細胞集落并傳代培養(yǎng)。(2)細胞免疫熒光檢測、普魯士藍染色、Western blot檢測和細胞內(nèi)ABC檢測等結(jié)果證實HSV1-sr39tk聯(lián)合GFP轉(zhuǎn)染MSCs及MION標(biāo)記成功。(3)增殖能力和代謝能力測定發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染后的MSCs細胞增殖代謝能力增強，MSCs表面抗原未發(fā)生變化，仍表現(xiàn)為干細胞表型。
　?。ㄈ?1)椎間盤修復(fù)效果:MSCs植入后3周，sr39tk組、sr39tk+MION組和M

11、ION組的Pfirrmann分級分別從4.45、4.36和4.20降為2.37、2.33和2.09。3組均顯示有顯著的椎間盤修復(fù)過程，3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第4周與第3周的結(jié)果相比，所有實驗組中的Pfirrmann分級沒有進一步改善。(2)MION組中，L2～L4椎間盤中MION信號強度、信號對比度(％)和低信號區(qū)面積(mm2)在MSCs植入后3天時與2周時對比（225.34±35.62vs.251.98±31.43;85.37±1

12、0.54vs.78.56±11.31;5.29±1.35vs.4.76±1.02），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。截至細胞植入后3周，這3個參數(shù)未均發(fā)生有統(tǒng)計學(xué)意義的變化。直到第4周時，這3個指標(biāo)與細胞植入后3周時相比，均發(fā)生了有統(tǒng)計意義的變化（751.43±52.67vs.243.76±21.43;47.37±5.01vs.77.79±9.98;1.78±0.31vs.4.67±1.14,P＜0.01)。在sr39tk+MION組中每個檢查時間點

13、上，MION信號強度、信號對比度(％)和低信號面積隨植入時間發(fā)生的改變均與MION組中的結(jié)果一致。
　　研究結(jié)論:
　?。ㄒ唬┩ㄟ^外科手術(shù)，以有限破壞纖維環(huán)和摘除少量髓核的辦法，可以穩(wěn)定誘導(dǎo)出犬椎間盤退變模型，并且在磁共振和組織染色中得到證實。實驗過程中動物損耗小，壞死過程基本符合椎間盤退變的病理生理表現(xiàn)，但是受制于人類直立行走的特點，這種動物模型在生物力學(xué)上與人類特征還有差異。
　?。ǘ?1)針對骨髓MSCs為異質(zhì)

14、性群體并且容易被成纖維細胞和血系細胞污染的情況，密度梯度離心與多次差速貼壁分離相結(jié)合的方法能夠提高細胞純度并縮短培養(yǎng)時間。(2)順序轉(zhuǎn)染HSV1-sr39tk、GFP和標(biāo)記MION的骨髓MSCs能夠功能表達相應(yīng)目標(biāo)蛋白。轉(zhuǎn)染后MSCs增殖代謝能力增強，表型不變，為最終植入體內(nèi)的步驟打下了良好的基礎(chǔ)。
　?。ㄈ?1)MSCs在植入本文的腰椎間盤退變模型后，能夠存活的時間不超過3周;納米氧化鐵顆粒標(biāo)記結(jié)合MR成像不能作為一個可靠的技

15、術(shù)來決定MSCs植入退變椎間盤后存活的確切時間。此外，在不超過3周的存活時間段內(nèi)，MSCs能夠促進退變椎間盤的修復(fù)，存活時間與椎間盤修復(fù)效果確切相關(guān)，但修復(fù)作用有限。(2)免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP陽性細胞比例隨時間增長期限在3周以內(nèi)。在本研究中，這樣的結(jié)果進一步證實植入MSCs在植入IVDD病灶后存活時間不超過3周。植入后髓核區(qū)域內(nèi)GFP陽性細胞與髓核細胞相關(guān)基質(zhì)成分Ⅱ型膠原、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素和髓核細胞表面標(biāo)志物缺氧誘導(dǎo)因子-1α、

16、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2均為陽性共染，提示MSCs受到髓核微環(huán)境的誘導(dǎo)，在體內(nèi)發(fā)生了趨向髓核細胞表型的分化，也改善了椎間盤內(nèi)基質(zhì)成分，是MSCs移植修復(fù)椎間盤退變的機制。
　　研究意義:
　　本研究的意義在于:為MSCs治療椎間盤退行性疾病提供基礎(chǔ)科學(xué)支持，在明確植入干細胞會發(fā)生何種轉(zhuǎn)歸的情況下，有助于提高植入干細胞的存活和靶向分化能力，改善植入微環(huán)境，最終目的是提高干細胞治療椎間盤退行性疾病的臨床效果。

17、>　　本研究的創(chuàng)新性:
　　(1)首次將HSV1-sr39tk聯(lián)合納米氧化鐵顆粒標(biāo)記MSCs，以構(gòu)建一種示蹤工具細胞。(2)首次使用一期PET-MR聯(lián)合的分子影像技術(shù)在體連續(xù)示蹤MSCs在椎間盤退變病灶中的轉(zhuǎn)歸。(3)在確認MSCs植入后存活時間窗的基礎(chǔ)上，利用組織免疫熒光定位雙相成像技術(shù)，提示移植的MSCs在椎間盤退變病灶中分化為有功能的髓核樣細胞參與椎間盤退變的修復(fù);初步闡明MSCs修復(fù)椎間盤退變的機制，為今后進一步改善修復(fù)效