結(jié)核分枝桿菌GntR-FadR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rv0494蛋白的功能研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是結(jié)核病的病原菌。眾所周知，結(jié)核病是一種慢性呼吸道的傳染病，肺部通常最易受侵襲，大約占10％發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌是目前致死率最高的致病菌之一[1]。研究表明:每年有上百萬(wàn)的人感染結(jié)核病，已經(jīng)成為死亡率僅次于艾滋病的第二大傳染病。盡管最近幾十年已經(jīng)有很多研究致力于研發(fā)新藥物來(lái)治療結(jié)核病，但是由于多重耐藥、廣泛耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌生物膜

2、的形成以及與HIV的共感染[2，3]，給人類治療結(jié)核病帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。
　　結(jié)核分枝桿菌在面對(duì)各種壓力環(huán)境下，主要通過(guò)進(jìn)化出一系列的修復(fù)機(jī)制、耐受機(jī)制以及自身內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制來(lái)維持其生存和繁殖。其中，結(jié)核分枝桿菌自身內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)其在各種壓力環(huán)境下的生存、致病性至關(guān)重要。目前，有研究表明:結(jié)核分枝桿菌的基因組中包含大量的潛在具有轉(zhuǎn)錄功能的基因，如GntR家族，因該家族成員和葡萄糖酸鹽調(diào)控因子具有相似性，故被稱為GntR[4]。

3、GntR家族許多成員已經(jīng)被證明對(duì)結(jié)核分枝桿菌在各種壓力環(huán)境下的存活發(fā)揮著重要的作用。該家族的一個(gè)顯著特點(diǎn)是N末端具有保守的DNA結(jié)合區(qū)域，主要是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的結(jié)合區(qū)域，但是其C末端域不具有保守性，主要是因?yàn)镃末端包含不同的效應(yīng)器結(jié)合域或者低聚物[5]。鑒于C末端域的異質(zhì)性，我們將GntR家族成員分類為不同的亞家族。目前，GntR家族成員可分為4個(gè)亞家族，分別是:FadR，HutC，MocR，YtrA亞家族[6，7]，Rv0494蛋白

4、則屬于FadR亞家族。這些調(diào)控因子在細(xì)胞生理中發(fā)揮重要的功能，多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控各種代謝途徑的基因，例如氧化壓力環(huán)境下所涉及到的氨基酸代謝或者其他代謝途徑[8]。
　　GntR家族轉(zhuǎn)錄因子通常發(fā)揮雙重調(diào)控功能，即同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的作用。在某些細(xì)菌中或者在某種特定條件下，GntR家族成員具有激活特定基因轉(zhuǎn)錄的功能，同時(shí)也能激活或阻遏其他基因轉(zhuǎn)錄。有趣的是，許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子還具有自調(diào)控功能，能夠調(diào)控自身基因的轉(zhuǎn)錄[9]。<

5、br>　　研究表明，結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中有7個(gè)基因包括:Rv0043c，Rv0165c，Rv0494，Rv0586, Rv0792c，Rv1152和Rv3060c編碼GntR蛋白，其中Rv0043c，Rv0165c，Rv0494，Rv0586和Rv3060c(Ⅰ和Ⅱ)編碼的相應(yīng)蛋白屬于FadR亞家族成員，F(xiàn)adR亞家族在GntR家族中最具有代表性[4]。因此，本文選擇FadR亞家族的Rv0494蛋白進(jìn)行研究其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能

6、。
　　目前，結(jié)核分枝桿菌GntR家族成員在分枝桿菌中是如何發(fā)揮相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能尚不明確。恥垢分枝桿菌是一種快生型的非致病性分枝桿菌，是被廣泛應(yīng)用于研究致病性結(jié)核分枝桿菌的模式細(xì)菌。
　　本文為研究GntR家族轉(zhuǎn)錄因子在分枝桿菌中的相關(guān)功能，從結(jié)核分枝桿菌基因組克隆Rv0494基因，分別進(jìn)行酶切連接構(gòu)建pET28-Rv0494和pNIT-Rv0494重組質(zhì)粒，從而通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)菌株M.s-pNIT(myc)-Rv0494，采

7、用電泳遷移率檢測(cè)(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，啟動(dòng)子活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)Rv0494蛋白能與自身啟動(dòng)子結(jié)合，這部分主要研究了該蛋白的自調(diào)控功能。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Rv0494過(guò)表達(dá)是否對(duì)恥垢分枝桿菌的菌落形態(tài)、生物膜形成、滑動(dòng)能力以及對(duì)一線抗結(jié)核藥物的耐受等產(chǎn)生影響，同時(shí)應(yīng)用十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，全文簡(jiǎn)寫(xiě)為SDS）、過(guò)氧

8、化氫(H2O2)、饑餓環(huán)境(PBS)、氧化劑聯(lián)氨等模擬各種壓力環(huán)境，鑒定Rv0494蛋白是否參與脅迫應(yīng)答，同時(shí)通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線檢測(cè)Rv0494對(duì)過(guò)表達(dá)菌株M.s-pNIT(myc)-Rv0494生長(zhǎng)速率的影響。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Rv0494蛋白能特異性與自身啟動(dòng)子結(jié)合屬于自調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)加入β-巰基乙醇處理證實(shí)Rv0494蛋白在體外是以單體形式存在。
　　另外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步空載和實(shí)驗(yàn)組重組恥垢分枝桿菌單菌落形態(tài)、滑動(dòng)能力和生物

9、膜形成、對(duì)抗生素的耐受以及脂肪酸的種類均無(wú)明顯差異。因此，初步證實(shí)Rv0494蛋白對(duì)恥垢分枝桿菌的表型無(wú)明顯影響。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)Rv0494重組蛋白對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)速率無(wú)明顯影響。但是，我們采用滴板和雙層瓊脂法比較對(duì)照菌和重組菌在H2O2和SDS以及氧化劑聯(lián)氨壓力下的存活差異。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)H2O2濃度在1％，SDS終濃度為5％時(shí)，重組菌的抑菌圈明顯小于空載菌，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)聯(lián)氨濃度為5mM時(shí)重組菌完全不生長(zhǎng)，而空載菌能夠生