血清1α,25-二羥維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的建立及其應用.pdf

1、目的:建立一種同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法測定血清1α，25-二羥維生素D2(1α，25(OH)2D2)和1α，25-二羥維生素D3(1α,25(OH)2D3);對基于不同方法學的1α，25-二羥維生素D(1α，25(OH)2D)檢測系統(tǒng)進行方法學評價及比較;應用本研究建立的LC-MS/MS方法測定表觀健康人群血清1α,25(OH)2D水平，嘗試建立生物參考區(qū)間。
　　方法:采集分離血清樣本，以同位素標記

2、的1α，25(OH)2D3作為內(nèi)標，正己烷-乙酸乙酯溶液作為提取劑，高速渦旋提取。離心后吸取上清，37℃真空離心干燥。殘渣用甲醇-水溶液重構(gòu)后應用LC-MS/MS分析技術(shù)進行分析檢測。采用正離子電噴霧離子化的多離子反應監(jiān)測模式，以標準品制作標準曲線結(jié)合穩(wěn)定同位素內(nèi)標法定量，建立LC-MS/MS法測定1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的方法。對添加不同水平1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3標準品的混合人血清

3、連續(xù)五天進行重復檢測，每次檢測每個水平樣本進行3次重復測定，以考察方法的精密度。同時評價血清樣本添加不同濃度標準品的加樣回收率。
　　收集2015年4月至6月期間北京協(xié)和醫(yī)院173例患者血清，同時應用本研究建立的LC-MS/MS方法和Diasorin化學發(fā)光免疫測定法(CLIA)檢測血清1αα，25(OH)2D3濃度水平并對Diasorin試劑盒檢測線性、精密度等性能進行評估。應用Excel2007對檢測精密度等數(shù)據(jù)及血清樣本檢測

4、結(jié)果進行統(tǒng)計分析，比較兩種方法的檢測性能及臨床樣本檢測結(jié)果。
　　收集2015年7月至2015年9月期間北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心200例表觀健康人血清，其中男性與女性各100人，年齡18～87歲。200例表觀健康人群中，有175例年齡小于65歲，從175例血清樣本中隨機抽取20例血清用于參考區(qū)間驗證，剩余155例血清用于參考區(qū)間建立。用本研究建立的LC-MS/MS法測定血清1α，25(OH)2D3和1α，25(OH)2D2濃度。以非參

5、數(shù)方法估計樣本的參考區(qū)間，取2.5％～97.5％百分位數(shù)的值作為參考范圍，并采用小樣本驗證的方法對參考區(qū)間進行驗證。
　　結(jié)果:用LC-MS/MS法在本實驗條件下可同時檢測血清1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3，化合物保留時間約為4.7 min，分析時間為10 min，特異性高，未見明顯干擾因素。化合物與內(nèi)標峰面積比與對應的濃度線性相關(guān)系數(shù)均大于0.990。1α,25(OH)2D2批內(nèi)和總變異分別為:3.88％～6

6、.35％和5.43％～9.41％，1α，25(OH)2D3批內(nèi)和總變異分別為2.34％～6.79％和5.37％～8.40％。1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的加祥回收率范圍分別為:95.80％～104.21％和95.91％～99.83％。1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的檢測限(LOD)均為5pg/mL，定量限(LOQ)均為10 pg/mL，具有較高的靈敏度。
　　Diasorin CLIA法測

7、定血清1α，25(OH)2D3濃度的批內(nèi)變異分別為2.7％、5.0％和5.0％，總變異分別為13.8％、15.0％和13.5％。取高值(167.8 pg/mL)和低值(36.4pg/mL)兩種血清按不同比例混合稀釋，并用Diasorin試劑盒重復測量檢測，評價Diasorin CLIA法檢測試劑盒的檢測線性，得到的線性方程為:y=0.916x+3.626(R2=0.991)。173例血清樣本兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)分析方程為:y=0.96

8、14x+4.3977，R2=0.8041。將兩種方法測定173例患者血清樣本結(jié)果作Bland-Altman圖，差值范圍為-23.1 pg/mL～26.1 pg/mL，5.78％(10/173)的樣本檢測結(jié)果落在95％一致性界限以外。LC-MS/MS法獲得人群的95％參考區(qū)間為32.9 pg/mL～112.5 pg/mL。
　　結(jié)論:本研究成功建立了同時測定血清1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的LC-MS/MS方法