NOX4通過調(diào)控PI3K-Akt信號促進NSCLC細胞增殖.pdf

1、目的：
　　1、研究NOX4對NSCLC細胞增殖的作用；
　　2、探索NOX4調(diào)控NSCLC細胞增殖的分子機制。
　　方法：
　　1、免疫組織化學法
　　采用免疫組織化學技術檢測152例NSCLC病人癌組織及癌旁組織中NOX4及p-Akt蛋白陽性率表達情況，并分析NOX4與臨床分期的相關性。
　　2、MTT法
　　用 pCMV-NOX4、pRS-shNOX4、pcDNA3.1-Akt載體構(gòu)建 N

2、OX4穩(wěn)定過表達、NOX4穩(wěn)定缺失、Akt過表達的A549和H460細胞，并將其接種于96孔板后檢測細胞的增殖能力。
　　3、細胞集落形成實驗
　　NOX4過表達、NOX4缺失、Akt過表達的A549和H460細胞種板后培養(yǎng)14天，檢測并比較NSCLC細胞的集落形成能力。
　　4、成瘤實驗
　　將NOX4過表達、NOX4缺失的A549和H460細胞懸液無菌皮下注射注入裸鼠體內(nèi)，每隔一天觀察并測量瘤體大小，記錄瘤體

3、的變化。
　　5、蛋白免疫印跡
　　驗證NSCLC細胞系中NOX4蛋白表達水平的高低，并檢測NOX4過表達的NSCLC穩(wěn)轉(zhuǎn)株中p-Akt、Akt的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、對NSCLC病人臨床標本分析得出，NOX4上調(diào)與NSCLC的臨床分期及預后（P＜0.001）密切相關，且NOX4在人NSCLC癌組織中的表達顯著高于癌旁正常肺組織，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2、體內(nèi)外實驗證明，

4、與對照組相比，NOX4過表達促進 NSCLC細胞的增殖和腫瘤的生長，NOX4缺失抑制NSCLC細胞的增殖和腫瘤的生長。
　　3、阻斷PI3K/Akt通路能有效逆轉(zhuǎn)NOX4過表達促進NSCLC細胞增殖的作用。當使用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002或Wartmannin時，NOX4促進NSCLC細胞增殖的作用被逆轉(zhuǎn)；與對照組相比，NOX4過表達能使A549和H460細胞中磷酸化Akt活性增強，NOX4缺失能使A549和H46

5、0細胞中磷酸化Akt活性降低（P＜0.05）；經(jīng)過分析152例NSCLC病人臨床標本得出，在肺腺癌和肺鱗癌中，NOX4高表達與 p-Akt的表達密切相關（P＜0.05）；對 NOX4過表達的A549和 H460細胞荷瘤鼠給予 LY294002，結(jié)果表明經(jīng)給藥后所形成的腫瘤比NOX4過表達組明顯減小。
　　4、在NSCLC細胞系中Akt和NOX4能相互激活并促進細胞增殖。在A549和H460細胞中，抑制 Akt后，NOX4的表達量下

6、調(diào)；A549和 H460細胞轉(zhuǎn)染Akt過表達質(zhì)粒后，NOX4的表達上調(diào)；當NOX4與Akt均過表達時促進NSCLC細胞增殖作用比對照組強（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、在NSCLC病人病理標本中NOX4表達量顯著增高；
　　2、NOX4過表達會促進NSCLC細胞的增殖；
　　3、PI3K/Akt通路激活參與NOX4調(diào)控NSCLC細胞的增殖作用；
　　2、NOX4和PI3K/Akt通路相互激活并促進N