整合素β6在膽管癌中的表達(dá)狀況及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和意義：
　　膽管癌(Cholangiocarcinoma)最早在1840年由Durand-Fardel教授報(bào)道，該腫瘤是一種膽管上皮源性的、高度惡性的腫瘤。在2010年第七版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(the American Joint Committee on Cancer，AJCC)的分類(lèi)中，根據(jù)發(fā)生部位不同膽管癌可以分為肝內(nèi)膽管癌(ICC)和肝外膽管癌(ECC)。ICC源于肝內(nèi)膽管以及其細(xì)小分支膽管樹(shù)的襯覆上皮;而對(duì)于E

2、CC，以膽囊管與肝總管匯合處分界，可進(jìn)一步分為肝門(mén)部膽管癌（又稱(chēng)Klatskin瘤）和遠(yuǎn)端膽管癌。盡管在世界范圍內(nèi)，膽管癌的發(fā)病率僅占所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤的3％左右，但作為肝膽系統(tǒng)第二常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率，尤其是ICC，近年來(lái)持續(xù)增高。目前為止，根治性手術(shù)切除是膽管癌唯一有效的根治方法。然而，由于該病起病隱匿、無(wú)特征性的早期臨床表現(xiàn)，且該腫瘤極易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，患者往往在確診時(shí)就已經(jīng)處于腫瘤晚期，失去了根治性切除

3、的機(jī)會(huì)。此外，膽管癌對(duì)輔助放療及化療的敏感性低，放化療并不能有效降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。上述這些因素導(dǎo)致絕大多數(shù)膽管癌患者的預(yù)后不良，5年生存率只有5％左右。因此，探尋在膽管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，尤其是其侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用的分子，明確其侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于治療膽管癌和降低死亡率具有十分重要的意義。
　　整合素屬于細(xì)胞表面黏附分子家族成員，是一類(lèi)由α亞單位及β亞單位以非共價(jià)鍵結(jié)合的方式組成的跨膜糖蛋白受體。整合素αvβ6是迄今為

4、止發(fā)現(xiàn)的唯一一種含有β6亞基的整合素，其表達(dá)特征為在胚胎發(fā)育時(shí)期、組織修復(fù)時(shí)以及在惡性上皮性腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常上皮組織、上皮良性腫瘤組織以及其它類(lèi)型惡性腫瘤組織中不表達(dá)。現(xiàn)階段研究已經(jīng)證實(shí)整合素αvβ6在胃癌、結(jié)直腸癌(CRC)、胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)等多種消化道惡性腫瘤中表達(dá)顯著提高，且αvβ6的表達(dá)水平與上述多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。此外，整合素αvβ6可通過(guò)活化多種經(jīng)典的促癌信號(hào)通路而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)我們

5、團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)αvβ6并不是固定表達(dá)于細(xì)胞膜表面，而是通過(guò)其自身的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過(guò)程在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜之間進(jìn)行快速地穿梭，該內(nèi)吞胞吐循環(huán)過(guò)程對(duì)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用及腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)起到了關(guān)鍵促進(jìn)作用。我們前期研究還發(fā)現(xiàn)αvβ6的β6亞基可直接與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)連接，該直接連接可活化ERK2下游相關(guān)信號(hào)通路并進(jìn)一步通過(guò)介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。此外，整合素β6還可以通過(guò)與

6、SDF-1及IL-8等趨化因子協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的器官靶向轉(zhuǎn)移。在腫瘤組織中特異性表達(dá)的特性及其在促進(jìn)腫瘤惡行進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮的重要作用使得整合素β6成為一個(gè)腫瘤診斷與治療的潛在靶點(diǎn)。但是，作為在多種消化道惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要分子，整合素β6在膽管癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制仍然不得而知。
　　Rac蛋白屬于Rho家族小GTP酶的重要成員之一，該家族成員包括Rac1，Rac2，Rac3和Rac1b。目前為止對(duì)于該家族成員

7、的相關(guān)研究多集中于Rac1方面。Rac1可作為細(xì)胞表面受體下游的關(guān)鍵分子，通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路而維持細(xì)胞的各項(xiàng)正常生理功能。研究發(fā)現(xiàn)Rac1在包括胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種消化道腫瘤組織中表達(dá)升高或活性增強(qiáng)，表達(dá)上調(diào)及活化后的Rac1參與了腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的多個(gè)方面，如腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。其中Rac1對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵促進(jìn)作用使其成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。該作用涉及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，如細(xì)

8、胞偽足的形成、細(xì)胞與細(xì)胞之間的結(jié)合、細(xì)胞與ECM之間的結(jié)合、ECM中膠原成分的水解等?，F(xiàn)階段研究證實(shí)了Rac1在多種膽管癌細(xì)胞系中均為高表達(dá)，且Rac1對(duì)于膽管癌細(xì)胞腫瘤微環(huán)境的形成、化療耐藥等過(guò)程起到至關(guān)重要的作用，但有關(guān)Rac1促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及相應(yīng)機(jī)制目前為止仍知之甚少。
　　為了明確整合素β6在膽管癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制，為以β6為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成抗腫瘤藥物提供研究基礎(chǔ)與理論支持，本文從以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究論證。(

9、1)收集了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院共95例膽管癌患者的病理組織標(biāo)本及相應(yīng)臨床資料，通過(guò)免疫組化的方式檢測(cè)了整合素β6在膽管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，分析了β6表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步利用ROC分析明確了β6可作為膽管癌診斷的一個(gè)免疫組化指標(biāo)，且β6表達(dá)情況可有效預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(2)隨后通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)β6能夠顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。(3)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)我們從多個(gè)角度研究發(fā)現(xiàn)β6是通過(guò)活化Rac1，

10、進(jìn)而增加F-actin的聚合及MMP-9的分泌而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移侵襲。(4)最后，我們利用裸鼠皮下成瘤動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證了β6促進(jìn)腫瘤發(fā)展的結(jié)論。通過(guò)本項(xiàng)目研究我們發(fā)現(xiàn)了整合素β6在腫瘤發(fā)展過(guò)程中作用的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)——Rac1，鑒于Rac1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到的關(guān)鍵作用，提示針對(duì)性地干預(yù)β6將有望減少膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移，對(duì)于膽管癌患者的綜合治療具有十分重要的臨床意義和應(yīng)用前景。
　　第一部分：整合素β6在膽管癌組織中的表達(dá)情

11、況及臨床病理特征的研究
　　目的：
　　明確整合素β6在膽管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，分析β6表達(dá)與患者各項(xiàng)臨床病理特征的聯(lián)系，探究整合素β6表達(dá)狀況的臨床病理學(xué)意義。
　　方法：
　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院于2006-2013年期間手術(shù)切除的膽管癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織病理標(biāo)本，并采集了相關(guān)臨床資料，采集的資料包括性別與年齡等一般資料，血清CA19-9水平，血清CEA水平，術(shù)后病理信息（包括浸潤(rùn)深度、

12、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化情況等）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。
　　2.在患者家屬知情同意的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)(IHC)的方法從蛋白水平檢測(cè)膽管癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織中β6的表達(dá)情況，并邀請(qǐng)兩名病理學(xué)家進(jìn)行免疫組化評(píng)分，結(jié)合相關(guān)臨床病理學(xué)參數(shù)，利用卡方檢驗(yàn)將量化的免疫組化評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　3.根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步利用ROC曲線分析β6作為膽管癌組織免疫組化指標(biāo)及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性與特異性。
　　結(jié)果：

13、　　1.研究共收集95例膽管癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，免疫組化結(jié)果顯示整合素β6在膽管癌組織中呈中-高程度表達(dá)，其表達(dá)位置主要位于細(xì)胞膜，胞漿中也可見(jiàn)少量表達(dá)，而在相應(yīng)的癌旁組織中整合素β6幾乎不表達(dá)。
　　2.β6的表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0003)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.0126)密切相關(guān)，而與年齡、性別、血清CA19-9與CEA水平、浸潤(rùn)深度及腫瘤分化情況無(wú)關(guān)(P＞0.05)。
　　3.ROC分析膽管癌與癌旁

14、組織β6表達(dá)情況的結(jié)果表明，β6高表達(dá)時(shí)其可作為膽管癌診斷的免疫組化標(biāo)記（曲線下面積AUC=0.876，P＜0.001），其敏感性與特異性分別為78.95％、93.68％。ROC分析伴或不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽管癌患者腫瘤組織中整合素β6表達(dá)情況的結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤組織免疫組化評(píng)分＞5分時(shí)可有效預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(AUC=0.701，P＜0.001)，其敏感性與特異性分別為77.55％及63.04％。
　　結(jié)論及意義：
　　整合素β6

15、在膽管癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)情況與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。整合素β6可以作為診斷膽管癌的免疫組化標(biāo)記物，且當(dāng)腫瘤組織β6表達(dá)的免疫組化評(píng)分＞5時(shí)，患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大。故我們建議膽管癌手術(shù)切除標(biāo)本常規(guī)行β6免疫組化染色，在輔助診斷膽管癌的同時(shí)，可用來(lái)預(yù)測(cè)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況以及推斷腫瘤的惡性程度。該部分結(jié)果提示整合素β6可能在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探討整合素β6對(duì)膽管癌細(xì)胞惡行生物學(xué)行

16、為的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　第二部分：整合素β6對(duì)膽管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的研究
　　目的：
　　在確定整合素β6在膽管癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)后，明確整合素β6對(duì)膽管癌細(xì)胞的活性、增殖能力、遷移及侵襲能力等惡性生物學(xué)行為的作用。
　　方法：
　　1.利用quantitative Real-time PCR、Western blot檢測(cè)兩種膽管癌細(xì)胞系RBE和QBC939

17、細(xì)胞中β6的表達(dá)情況。
　　2.分別將膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939分為4組，對(duì)照組(NC)及β6干擾組(siβ6);空白質(zhì)粒對(duì)照組(Mock)及β6過(guò)表達(dá)組(β6 transfectant)。分別利用quantitative Real-time PCR及Western blot在mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)干擾效果及過(guò)表達(dá)效果。
　　3.采用CCK8法檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)整合素β6后膽管癌細(xì)胞RBE和QBC939活性的變化。

18、r>　　4.采用MTT法檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)整合素β6后膽管癌細(xì)胞RBE和QBC939增殖能力的變化情況。
　　5.利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述各組膽管癌細(xì)胞遷移能力的差異。
　　6.利用預(yù)先包被Matri-gel的Transwell侵襲小室檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)整合素β6后膽管癌細(xì)胞侵襲能力的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939在mRNA水平和蛋白水平均中度表達(dá)β6，siβ6

19、可顯著降低兩種細(xì)胞中整合素β6的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染整合素β6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后可在mRNA及蛋白水平上檢測(cè)到β6表達(dá)明顯升高。
　　2.CCK8實(shí)驗(yàn)表明干擾β6表達(dá)后，兩種膽管癌細(xì)胞系細(xì)胞活性受到明顯抑制，而過(guò)表達(dá)β6后，細(xì)胞活性顯著增加。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干擾整合素β6表達(dá)可顯著抑制膽管癌細(xì)胞的增殖能力，反之過(guò)表達(dá)整合素β6則可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖。
　　4.細(xì)胞劃痕與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾整合素β6表達(dá)可

20、顯著抑制膽管癌細(xì)胞的遷移能力，而過(guò)表達(dá)整合素β6可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移。
　　5.利用預(yù)先包被Matri-gel的Transwell小室我們發(fā)現(xiàn)干擾整合素β6表達(dá)后，膽管癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，而過(guò)表達(dá)整合素β6可明顯提高膽管癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分內(nèi)容旨在研究整合素β6對(duì)膽管癌細(xì)胞各項(xiàng)惡行生物學(xué)行為的影響。首先明確了 RBE與QBC939兩種細(xì)胞系中在mRNA水平及蛋白水平均有中等量β6的表

21、達(dá)，故進(jìn)一步均對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行了β6干擾及過(guò)表達(dá)處理，隨后利用CCK8、MTT、細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)探究了β6對(duì)這兩種膽管癌細(xì)胞的活性、增殖能力、遷移及侵襲能力的影響。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整合素β6可以顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的活性、增殖能力、遷移能力及侵襲能力。該部分研究豐富了膽管癌發(fā)生發(fā)展的理論基礎(chǔ)，也補(bǔ)充了整合素β6對(duì)在膽管癌作用研究方面的空白，并為進(jìn)一步探究整合素β6促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制研究打下了基礎(chǔ)。
　　第

22、三部分：整合素β6通過(guò)活化Rac1促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：
　　研究發(fā)現(xiàn)Rac1是腫瘤發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵分子，在組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)確定整合素β6與膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)后，探究整合素β6是否通過(guò)Rac1通路促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.干擾或過(guò)表達(dá)β6后，PAK-PBD pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞Rac1的活性。
　　2.利用不同濃度的Rac1抑制劑處理膽管癌細(xì)

23、胞RBE及QBC939，隨后檢測(cè)處理后膽管癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的變化情況。
　　3.膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939利用50μM的NSC23766處理后，分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒及β6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，Transwell檢測(cè)兩種膽管癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的變化情況。
　　4.膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939均分為四組，分別共轉(zhuǎn)染對(duì)照(NC)/Rac1小干擾RNA(siRac1)及空白質(zhì)粒(Mock)/β6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(β6 transfe

24、ctant)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述不同處理對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響。
　　5.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)及ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)β6后兩種膽管癌細(xì)胞中及細(xì)胞上清中uPA，MMP2，MMP3，MMP9表達(dá)量的變化。
　　6.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)及ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)干擾Rac1表達(dá)后兩種膽管癌細(xì)胞中及細(xì)胞上清中uPA，MMP2，MMP3，MMP9表達(dá)量的變化。
　　7.N

25、SC23766處理膽管癌細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染β6小干擾RNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膽管癌細(xì)胞上清中MMP9水平的變化。
　　8.膽管癌RBE及QBC939轉(zhuǎn)染β6小干擾RNA后，利用熒光標(biāo)記的Phalloidin對(duì)細(xì)胞微絲骨架蛋白F-actin進(jìn)行染色，共聚焦顯微鏡觀察膽管癌細(xì)胞中微絲骨架蛋白F-actin聚合的情況。
　　9.Rac1抑制劑處理膽管癌細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染整合素β6小干擾RNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，利用熒光標(biāo)記的Phall

26、oidin對(duì)F-actin染色，共聚焦顯微鏡觀察膽管癌細(xì)胞中F-actin聚合的情況。
　　結(jié)果：
　　1.干擾β6表達(dá)后細(xì)胞Rac1活性降低，過(guò)表達(dá)β6后細(xì)胞Rac1活性顯著增強(qiáng)，β6的表達(dá)對(duì)細(xì)胞中Rac1總量的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　2.Rac1抑制劑NSC23766可顯著抑制膽管癌細(xì)胞遷移及侵襲能力，且該抑制作用具有濃度依賴(lài)性。
　　3.過(guò)表達(dá)整合素β6后膽管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)，但經(jīng)過(guò)Rac1抑制

27、劑處理后的對(duì)照組與整合素β6過(guò)表達(dá)組之間的差異消失，Rac1干擾RNA也有類(lèi)似于NSC23766的效果。
　　4.Real-time PCR結(jié)果顯示，在膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939中，干擾整合素β6的表達(dá)可顯著降低膽管癌細(xì)胞mRNA水平MMP9的表達(dá)，而uPA、MMP2及MMP3表達(dá)無(wú)明顯變化。過(guò)表達(dá)整合素β6可顯著提高膽管癌細(xì)胞MMP9在mRNA水平的表達(dá)，對(duì)uPA、MMP2及MMP3表達(dá)無(wú)顯著作用。
　　5.ELISA

28、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾β6可顯著降低細(xì)胞蛋白水平MMP9的表達(dá)，過(guò)表達(dá)β6可顯著提高細(xì)胞MMP9在蛋白水平的表達(dá)。
　　6.Real-time PCR結(jié)果顯示，在膽管癌細(xì)胞RBE及QBC939中，干擾Rac1的表達(dá)可顯著降低細(xì)胞mRNA水平MMP9的表達(dá)，而對(duì)uPA、MMP2及MMP3表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　7.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾Rac1表達(dá)可顯著降低膽管癌細(xì)胞上清中MMP9的表達(dá)。
　　8.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

29、，干擾β6可顯著降低細(xì)胞上清MMP9蛋白的表達(dá)，過(guò)表達(dá)β6可顯著提高細(xì)胞上清中MMP9蛋白的表達(dá)，但經(jīng)過(guò)NSC23766處理后，NC組與β6干擾組以及Mock組與β6過(guò)表達(dá)組之間MMP9蛋白表達(dá)的差異消失。
　　9.Phalloidin熒光染色結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞中微絲豐富、形態(tài)規(guī)則、排列整齊，呈聚合狀態(tài)，而β6干擾后微絲出現(xiàn)了明顯的解聚。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示干擾整合素β6表達(dá)后可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞中F-actin的解聚。
　　10

30、.Phalloidin熒光染色結(jié)果顯示，干擾β6可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞中F-actin的解聚，過(guò)表達(dá)β6可顯著抑制細(xì)胞中F-actin的解聚，而經(jīng)過(guò)Rac1抑制劑NSC23766處理后，不同處理組膽管癌細(xì)胞中F-actin解聚狀態(tài)均明顯增加，且整合素β6表達(dá)狀況對(duì)F-actin解聚狀態(tài)的影響消失。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分內(nèi)容旨在探究整合素β6促進(jìn)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。首先直接證實(shí)整合素β6可以明顯增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞中Ra

31、c1的活性，而對(duì)細(xì)胞Rac1表達(dá)總量無(wú)明顯影響，并利用不同濃度的Rac1抑制劑證實(shí)了Rac1在膽管癌細(xì)胞的遷移侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，進(jìn)一步利用Rac1抑制劑及特異性小干擾RNA從兩個(gè)角度證實(shí)Rac1參與了β6調(diào)控的膽管癌細(xì)胞的遷移侵襲過(guò)程。隨后我們發(fā)現(xiàn)β6可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞MMP9的表達(dá)，并進(jìn)一步證實(shí)β6是通過(guò)Rac1通路發(fā)揮作用的。通過(guò)Phalloidin熒光染色我們證實(shí)β6可以顯著促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合，且該作用也是

32、通過(guò)增強(qiáng)Rac1的活性而實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，我們發(fā)現(xiàn)了β6促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲作用的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)——Rac1，并證實(shí)了β6是通過(guò)活化Rac1促進(jìn)F-actin的聚合及MMP9的分泌從而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞遷移侵襲的。鑒于Rac1在多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的發(fā)揮的關(guān)鍵作用，該發(fā)現(xiàn)無(wú)疑豐富了整合素β6的相關(guān)理論，并為研究整合素β6相關(guān)的靶向治療藥物來(lái)抑制膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ)。
　　第四部分：整合素β6促進(jìn)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)與腫瘤組

33、織MMP9的表達(dá)
　　目的：
　　在前期體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)β6對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移侵襲能力的促進(jìn)作用及相應(yīng)機(jī)制后，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證β6促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
　　方法：
　　1.分別構(gòu)建整合素β6干擾慢病毒載體及過(guò)表達(dá)慢病毒載體;
　　2.體外培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染整合素β6干擾慢病毒載體及過(guò)表達(dá)慢病毒載體的膽管癌細(xì)胞RBE，將其接種于裸鼠皮下建立裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停闪鲞^(guò)程中測(cè)量腫瘤大小，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　3.處死裸鼠

34、后測(cè)量腫瘤體積與重量，并將腫瘤組織石蠟包埋后切片，免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中整合素β6和MMP9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.相對(duì)于對(duì)照組，整合素β6干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，同時(shí)腫瘤的體積和重量顯著減小;而整合素β6過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯加快，且腫瘤的體積和重量顯著增加。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，β6干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中β6表達(dá)顯著降低，相應(yīng)的MMP9表達(dá)

35、也明顯降低;而β6過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染組腫瘤組織內(nèi)β6表達(dá)顯著升高，相應(yīng)的MMP9表達(dá)也顯著增高。
　　結(jié)論及意義：
　　本部分是利用裸鼠皮下成瘤模型對(duì)前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。該部分結(jié)果證實(shí)，β6不僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以明顯促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移侵襲，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也可以明顯促進(jìn)裸鼠皮下腫瘤組織的生長(zhǎng)，同時(shí)也可以增加腫瘤組織內(nèi)MMP9的表達(dá)，提示高表達(dá)整合素β6的腫瘤組織有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。通過(guò)該部分研究我們進(jìn)一步