一株來自海洋淤泥的銅綠假單胞菌株DEs-3的鑒定及基因ap02對其產(chǎn)堿性蛋白酶的影響研究.pdf

1、海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，其多樣獨特的環(huán)境造就了有別于其它生態(tài)環(huán)境的微生物資源，僅海底軟泥中的生物量就占地球總生物量的10％～30％之多。堿性蛋白酶廣泛存在于細菌、真菌和動植物體內(nèi)，可用于洗滌、食品、紡織、醫(yī)藥和生命科學等領(lǐng)域，其中洗滌行業(yè)應用最為廣泛。從海洋環(huán)境中篩選出高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株已成為研究熱點。
　　本研究以遼寧營口海洋淤泥為環(huán)境樣品，采用蛋白酶的活性篩選策略，得到一株產(chǎn)蛋白酶優(yōu)勢菌株。通過微生物形態(tài)學特征、生理生化性

2、質(zhì)、16SrDNA基因鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹等方面的分析，判斷該菌屬于銅綠假單胞桿菌屬，命名為Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3。其發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級沉淀和超濾后，測得其最適反應溫度和pH分別為55℃和9.0，在4-55℃和pH7.0-9.0的范圍內(nèi)有很好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。Fe2+、Ca2+對酶活有明顯促進作用;Zn2+、Cu2+、Fe3+、pb2+、Ni2+對酶活有明顯抑制作用。PMSF會徹底抑制酶活，推

3、測該酶是絲氨酸蛋白酶類，能與部分表面活性劑較好的互溶。
　　前期實驗室構(gòu)建了宏基因組AL01文庫，編號pGXAA2011擁有一個完整蛋白酶基因的陽性克隆。生物信息學分析結(jié)果表明，該陽性克隆包括的一個長為1146 bp的ORF，編碼381個氨基酸，蛋白分子量約為39.46 kDa，命名該基因為ap02。在氨基酸水平上，與Salinibacillus aidingensis（登錄號為WP_044156525.1）的peptidase基

4、因一致性為100％，該序列來自全基因組測序的功能注釋，暫無其他生化特性研究。
　　擴增基因ap02與表達載體pET-32a(+)連接轉(zhuǎn)化至Escherichia coliBL21(DE3)pLysS表達宿主中，構(gòu)建重組表達載體。測得粗酶最適反應溫度和pH分別為65℃和9.0，在4-45℃和pH7.0-9.0范圍內(nèi)有很高的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。Ca2+、Mn2+對酶活有明顯激活作用，F(xiàn)e2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+對酶活有明顯

5、的抑制作用。PMSF和EDTA對酶活力有強烈抑制作用，推測該酶屬于絲氨酸蛋白酶類，且有一定的金屬依賴性。
　　將基因ap02與廣宿主表達載體pMP2444和pBBR1MCS-5連接，轉(zhuǎn)化至以0.3 M蔗糖溶液為電轉(zhuǎn)化介質(zhì)的Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3感受態(tài)細胞中，構(gòu)建基因工程菌株。研究發(fā)現(xiàn)在同一溫度下，兩個基因工程菌株的酶活力均比野生菌株DES-3的酶活力稍低，但基因工程菌株DES-3/pBBR1