冷凍干燥牙本質(zhì)在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、齲齒、牙周病、創(chuàng)傷等,是引起牙齒缺失最常見的一類疾病?，F(xiàn)有牙齒缺失的治療方法主要是傳統(tǒng)義齒修復(fù)或種植體修復(fù),但傳統(tǒng)義齒修復(fù)是一種被動的、需要余留組織補(bǔ)償?shù)男迯?fù)方式,不能完全恢復(fù)咀嚼效率;而種植修復(fù)雖然能克服缺牙數(shù)目的限制,但由于其與牙槽骨的剛性連接缺乏牙周膜結(jié)構(gòu)的緩沖、感知功能及天然的細(xì)胞封閉作用,故存在感染或因牙合力過大導(dǎo)致骨吸收的風(fēng)險,與天然牙齒相比仍有較大的差異。
　　牙缺失治療的研究熱點(diǎn)之一是利用組織工程再生牙組織。現(xiàn)今牙

2、再生的瓶頸之一是缺乏理想的組織工程支架材料以提供種子細(xì)胞合適的生長環(huán)境。支架材料除了應(yīng)具有良好的機(jī)械性能、良好的生物相容性,還應(yīng)含有豐富的成牙相關(guān)生物活性因子以誘導(dǎo)種子細(xì)胞向成牙的方向分化,并應(yīng)易于保存和運(yùn)輸。牙本質(zhì)來源廣泛,具有的特殊組織結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)種子細(xì)胞的成牙能力。牙本質(zhì)基質(zhì)成分十分復(fù)雜,包含成牙相關(guān)的所有蛋白和因子并具有潛在的免疫原性。冷凍干燥技術(shù)(簡稱凍干)能使物料在干燥的同時能夠保持自身的結(jié)構(gòu)、形狀和性質(zhì),很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用

3、。本課題擬通過冷凍干燥技術(shù)對牙本質(zhì)進(jìn)行處理,以降低牙本質(zhì)的免疫原性、保護(hù)其中的生物活性物質(zhì),方便牙本質(zhì)支架材料的保存和運(yùn)輸,對制成的凍干牙本質(zhì)進(jìn)行機(jī)械力學(xué)性能檢測,并通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)對凍干牙本質(zhì)的生物相容性和誘導(dǎo)成牙能力進(jìn)行評估,以期獲得適宜牙再生的凍干牙本質(zhì)生物支架材料。
　　第一部分冷凍干燥牙本質(zhì)(FDDM)的制作及材料性能檢測
　　研究目的：
　　1)制作冷凍干燥牙本質(zhì)生物支架材料
　　2)檢測FDDM的機(jī)

4、械力學(xué)性能及膠原釋放能力
　　研究方法：
　　1)在去除牙髓、牙周組織的基礎(chǔ)上,將經(jīng)深冷凍的牙本質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥處理,輻照滅菌,真空包裝保存。
　　2)通過壓實(shí)驗(yàn)、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)以及維氏顯微硬度實(shí)驗(yàn)檢測凍干牙本質(zhì)的機(jī)械力學(xué)性能;ELISA法檢測材料的膠原釋放能力;通過掃面電鏡、HE染色觀察FDDM的組織結(jié)構(gòu)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1)得到的凍干牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)均一,在形狀、大小、色澤上沒有顯著變化。
　　2)凍

5、干牙本質(zhì)與普通牙本質(zhì)的抗壓強(qiáng)度沒有顯著性差異,但這兩個牙本質(zhì)組的抗壓強(qiáng)度與HA組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),抗壓強(qiáng)度遠(yuǎn)高于HA;抗壓彈性模量、撓曲強(qiáng)度、撓曲彈性模量檢測結(jié)果顯示相同趨勢;FDDM的I型膠原(COL-1)釋放能力與普通牙本質(zhì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;FDDM的維氏顯微硬度略高于普通牙本質(zhì);凍干處理對牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響不顯著。
　　結(jié)論：
　　制作出的FDDM與普通牙本質(zhì)相比具有相似的組織結(jié)構(gòu)、機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度、COL-1

6、釋放能力及略高的表面硬度。
　　第二部分冷凍干燥牙本質(zhì)生物相容性檢測及對DPSCs的影響。
　　研究目的：
　　1)體外分離培養(yǎng)并鑒定DPSCs的生物學(xué)特性
　　2)體外檢測凍干牙本質(zhì)(FDDM)的生物相容性及對牙髓干細(xì)胞(DPSCs)的影響
　　研究方法：
　　1)對從人牙髓組織中分離出的DPSCs進(jìn)行克隆形成能力、多向分化能力及間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞檢測。
　　2)對FDDM表面的

7、DPSCs進(jìn)行細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期;膠原分泌;ALP活性檢測;Real-time PCR檢測FDDM表面DPSCs成牙、成骨及相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)分泌基因表達(dá);細(xì)胞免疫熒光染色檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1)分離培養(yǎng)出的DPSCs具有克隆形成能力和多向分化潛能;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞特定抗原表達(dá)顯示:STRO-1,CD29,CD90,CD105及CD44表達(dá)呈陽性,而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45以及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志C

8、D31表達(dá)呈陰性。結(jié)果符合牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)。
　　2)凍干牙本質(zhì)同普通牙本質(zhì)一樣,對牙髓干細(xì)胞具有良好的生物相容性,在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、膠原分泌及成牙、細(xì)胞外基質(zhì)分泌的相關(guān)基因、蛋白表達(dá)上均優(yōu)于羥基磷灰石-磷酸三鈣,但ALP活性及骨向分化相關(guān)的基因、蛋白表達(dá)均低于羥基磷灰石-磷酸三鈣。
　　結(jié)論：
　　1)成功分離培養(yǎng)出DPSCs。
　　2) FDDM具有良好的生物相容性,與HA相比,能夠促進(jìn)D

9、PSCs的活性及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,促進(jìn)DPSCs的牙向分化。但降低DPSCs的骨向分化能力。
　　第三部分利用冷凍干燥牙本質(zhì)進(jìn)行牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究目的：
　　1)體內(nèi)驗(yàn)證凍干牙本質(zhì)(FDDM)的生物相容性和誘導(dǎo)DPSCs再生牙髓-牙本質(zhì)樣復(fù)合體的能力
　　研究方法：
　　將DPSCs細(xì)胞膜片聚集體分別與FDDM、普通牙本質(zhì)(D)和HA復(fù)合后進(jìn)行裸鼠皮下移植,每只裸鼠背部皮下植入一

10、枚牙髓干細(xì)胞膜片-支架復(fù)合體,SPF級別飼養(yǎng)8周后進(jìn)行HE染色、馬氏三色染色及相關(guān)蛋白的免疫組化染色。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　凍干牙本質(zhì)/普通牙本質(zhì)-牙髓干細(xì)胞復(fù)合物再生出牙髓-牙本質(zhì)樣組織,極性的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞沿著新生成的前期牙本質(zhì)整齊排列,且沒有觀察到炎癥反應(yīng)。羥基磷灰石-磷酸三鈣-牙髓干細(xì)胞復(fù)合物中沒有觀察到典型的牙髓-牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成,可見炎性細(xì)胞浸潤。免疫組化染色顯示普通牙本質(zhì)與凍干牙本質(zhì)陽性表達(dá)ALP、COL-3、