應(yīng)用噬菌體展示肽技術(shù)篩選塵螨變應(yīng)原B細(xì)胞表位模擬肽及其體內(nèi)外生物學(xué)功能的研究.pdf

1、塵螨是引起變應(yīng)性疾病的主要變應(yīng)原，用塵螨變應(yīng)原提取物進(jìn)行臨床檢測(cè)和特異性免疫治療應(yīng)用廣泛。然而塵螨提取物受原材料和提取技術(shù)等因素的影響，在蛋白成分、含量及純度等方面差異性大，直接影響了臨床診斷的準(zhǔn)確性以及特異性免疫治療的療效和安全性。
　　本研究中，我們拋開對(duì)變應(yīng)原本身的研究，用塵螨變應(yīng)原陽性患者血清中針對(duì)塵螨的特異性IgE抗體為釣餌，進(jìn)行由果到因的反推。通過噬菌體展示隨機(jī)肽技術(shù)進(jìn)行陰陽雙重篩選，得出與塵螨特異性IgE結(jié)合的模擬肽

2、。首先用塵螨變應(yīng)原IgE陰性的過敏患者血清中IgE進(jìn)行陰性篩選排除IgE保守的重鏈結(jié)合肽，再用塵螨陽性患者血清中IgE為釣餌，得到和IgE抗體高變區(qū)結(jié)合的塵螨B細(xì)胞線性以及構(gòu)象表位模擬肽庫。為了驗(yàn)證篩選的塵螨B細(xì)胞表位模擬肽的體內(nèi)生物學(xué)功能，我們利用戶塵螨誘發(fā)的變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘小鼠模型，觀察所篩選的塵螨B細(xì)胞表位模擬肽1，2與3對(duì)小鼠模型氣道炎癥的治療作用，為進(jìn)一步研制和開發(fā)塵螨特異性免疫治療的B細(xì)胞表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、　　一、與塵螨IgE結(jié)合的噬菌體的篩選
　　1、噬菌體的親和篩選：以塵螨IgE陰性的過敏患者血清IgE為誘餌進(jìn)行陰性篩選，獲得不能結(jié)合的噬菌體，然后再以塵螨陽性患者血清IgE抗體為誘餌進(jìn)行陽性篩選，選出能夠結(jié)合的噬菌體。在篩選過程中，通過降低釣餌的濃度、減少釣餌與肽庫作用時(shí)間、增加洗脫強(qiáng)度，去除不能與塵螨 IgE結(jié)合和與塵螨IgE結(jié)合較弱的噬菌體，經(jīng)三輪篩選后得到富集程度較高的分別與塵螨IgE特異性結(jié)合的噬菌體克隆。
　　2

4、、挑選與IgE特異性結(jié)合的噬菌體克?。簭慕?jīng)過陰性和陽性篩選后的洗脫物中隨機(jī)挑選出100個(gè)噬菌體單克隆，通過ELISA技術(shù)進(jìn)一步鑒定其與塵螨IgE結(jié)合的特異性，結(jié)果得到84個(gè)能與塵螨IgE特異性結(jié)合的噬菌體。
　　3、DNA測(cè)序與多肽合成：將84個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序后，除去相同序列以及克隆無效的序列，最后獲得44個(gè)噬菌體克隆。將這44個(gè)噬菌體單克隆的DNA序列與塵螨主要變應(yīng)原分子Derp1，Derp2，Der p5與Der p

5、7的三維結(jié)構(gòu)通過軟件比對(duì)，將3個(gè)特異性強(qiáng)且氨基酸序列與塵螨主要變應(yīng)原比對(duì)性高的噬菌體單克隆合成模擬肽。
　　二、戶塵螨模擬環(huán)肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘模型的作用
　　以戶塵螨誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎伴哮喘的小鼠為模型，觀察3個(gè)合成模擬肽在體內(nèi)對(duì)變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘的干預(yù)作用，設(shè)正常對(duì)照組，變應(yīng)性鼻炎伴哮喘模型組以及模擬肽干預(yù)組1/2/3。100μl戶塵螨提取液滴鼻致敏后，正常對(duì)照組以生理鹽水滴鼻激發(fā)，模型組與模擬肽干預(yù)組以1

6、00μl戶塵螨提取液激發(fā)。模擬肽干預(yù)組采用合成肽（500μg合成肽+200μl PBS）溶液皮下注射連續(xù)給藥干預(yù)（1次/天）4天。再次激發(fā)后處死小鼠，進(jìn)行一系列觀察與檢測(cè)，結(jié)果如下：
　　1、模擬肽干預(yù)組小鼠的抓鼻、流清涕、打噴嚏的癥狀明顯改善，無口唇發(fā)紺、喘氣以及呼吸頻率加快等癥狀。
　　2、模擬肽干預(yù)組氣道阻力較模型組明顯降低。
　　3、模擬肽干預(yù)組鼻黏膜上皮細(xì)胞完整，無柱狀和杯狀細(xì)胞增生，黏膜下層無腺體增生、無中

7、性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，僅有少量嗜酸性粒細(xì)胞；模擬肽干預(yù)組肺組織血管與支氣管炎癥浸潤明顯減少、氣道上皮結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)。
　　4、模擬肽干預(yù)組1、2、3鼻黏膜上皮IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組；模擬肽干預(yù)組肺組織中IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組。
　　5、模擬肽干預(yù)組鼻腔與支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞均顯著低于模型組。
　　6、鼻腔灌洗液：模擬肽干預(yù)組IL-4水平明顯低于模

8、型組，干預(yù)組2、3 IL-10水平明顯高于模型組，干預(yù)組3中IL-25水平明顯低于模型組，干預(yù)組IFN-γ水平明顯高于模型組；肺泡灌洗液：模擬肽干預(yù)組IL-4水平明顯低于模型組，干預(yù)組1、3 IL-10水平明顯高于模型組，干預(yù)組IL-25水平明顯低于模型組，干預(yù)組1、2中IL-33水平明顯低于模型組，干預(yù)組1、3中IFN-γ水平明顯高于模型組。
　　7、模擬肽干預(yù)組血清戶塵螨特異性IgE抗體水平明顯低于模型組，而IgG1抗體水平則