從噬菌體7肽庫(kù)中篩選哇巴因特異性結(jié)合短肽并初步分析其生物學(xué)活性.pdf

1、目的：從噬菌體7肽庫(kù)中篩選與哇巴因特異性結(jié)合的短肽，并分析其生物學(xué)活性，為研究哇巴因與鈉泵的相互作用及防治內(nèi)源性哇巴因相關(guān)的原發(fā)性高血壓奠定基礎(chǔ)。 方法： (1)哇巴因特異性結(jié)合短肽的篩選 ①親和篩選用哇巴因和卵清蛋白復(fù)合物包被酶標(biāo)板，牛血清白蛋白封閉，快速洗板，加入稀釋噬菌體文庫(kù)，棄去未結(jié)合噬菌體，洗脫，收集洗脫液。將洗脫液加入大腸桿菌ER2738增殖培養(yǎng)。重復(fù)以上操作3次，獲得高度富集的噬菌體。 ②吸

2、附實(shí)驗(yàn)用卵清蛋白包被酶標(biāo)板，加入第3輪淘篩的噬菌體，收集未結(jié)合的噬菌體，測(cè)定滴度。重復(fù)3次后保存洗脫液。 ③滴度測(cè)定將3輪淘選產(chǎn)物與ER2738混合接種于IPTG-Xgal培養(yǎng)板上。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板上的藍(lán)斑。 ④ELISA法鑒定用哇巴因與卵清蛋白復(fù)合物包被ELISA板的各孔，依次加入第3輪擴(kuò)增后噬菌體、抗M13抗體和底物溶液H2O2，酶標(biāo)儀測(cè)A450值。 ⑤噬菌體陽(yáng)性克隆ssDNA的提取及測(cè)序分析，并推導(dǎo)出短肽序列，合

3、成多肽。 ⑥同源性分析：應(yīng)用NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)，比較推導(dǎo)出的氨基酸序列同已知蛋白質(zhì)的同源性。 (2)哇巴因結(jié)合肽生物學(xué)活性的檢測(cè) ①采用放射性核素標(biāo)記法測(cè)定3H-哇巴因與哇巴因結(jié)合肽的結(jié)合活性。 ②MTT比色法檢測(cè)哇巴因結(jié)合肽對(duì)哇巴因所致血管內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926生長(zhǎng)抑制的影響。 ③形態(tài)學(xué)觀(guān)察：倒置光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；Hoechst33342/PI雙熒光染色，熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞死

4、亡特征。 ④半定量RT-PCR法檢測(cè)哇巴因結(jié)合肽對(duì)哇巴因所致鈉泵α1亞單位、β1亞單位、VE-cadherin和Snail mRNA表達(dá)改變的影響。 結(jié)果： (1)從噬菌體7肽庫(kù)中篩選出與卵清蛋白-哇巴因藕聯(lián)物特異性結(jié)合肽的效率：第1輪：2.0×10-3％，第2輪：2.1×10-3％，第3輪：3.8％。使與卵清蛋白-哇巴因藕聯(lián)物特異性結(jié)合肽得到高度富集。2×1013pfu/ml的噬菌體庫(kù)經(jīng)過(guò)3輪卵清蛋白包板吸附實(shí)

5、驗(yàn)，特異地與哇巴因結(jié)合的噬菌體庫(kù)為1.8×102pfu/ml，經(jīng)過(guò)3輪淘選并經(jīng)ELISA鑒定，從噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選得到14個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其ssDNA進(jìn)行測(cè)序分析。篩選出3種多肽：肽A的篩選一致率達(dá)到64.3％(9/14)，共有堿基序列：CAACGTACTGGACGTCCACT，蛋白序列：RCMTSRS，同源蛋白：一種多蛋白復(fù)合體，位于其643-648位置，主要參與細(xì)胞的多種信號(hào)傳遞；肽B的篩選一致率為28.6％(4/14)，共有堿基

6、序列：GAGCGTTGGTGCATGGTGTG，蛋白序列：LATTVPH,同源蛋白：氨甲酰天冬氨酸脫水酶，位于其26-32位置；肽C的篩選一致率為7.14％(1/14)，共有堿基序列：TGCGTGTGTATGGATGG，蛋白序列：TATTIPT，同源蛋白：一種假象蛋白，位于其248-252位置。 (2)放射配基實(shí)驗(yàn)結(jié)果：哇巴因結(jié)合肽能與3H-哇巴因結(jié)合，其回歸方程：B/F=-0.743B+94.5276(r=-0.768)，Kd

7、=0.836nmol/L，Bmax=127.7 fmol/mg蛋白。結(jié)果表明，3H-哇巴因與哇巴因結(jié)合肽(OCP)結(jié)合的平衡解離常數(shù)為0.836 nmol/L，受體密度為127.7 fmol/mg。 (3)哇巴因可抑制EAhy926細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性；高濃度哇巴因(10μmol/L)對(duì)細(xì)胞有劇烈抑制作用，而低濃度(0.001μmol/L)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯降低。經(jīng)直線(xiàn)回歸計(jì)算24h、48h、72h IC50值分

8、別為0.507、0.126、0.038μmol/L。 (4)哇巴因結(jié)合肽拮抗作用：哇巴因結(jié)合肽可拮抗哇巴因?qū)Ahy926細(xì)胞抑制生長(zhǎng)作用，且呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性；高濃度哇巴因結(jié)合肽(100μmol/L)對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)保護(hù)作用，而低濃度(0.001μmol/L)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用則明顯降低。經(jīng)直線(xiàn)回歸計(jì)算24h、48h、72h IC50值分別為0.612、0.364、0.174μmol/L。 (5)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：EAhy92

9、6為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，哇巴因作用后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。5-10/μmol/L哇巴因作用，12h后即引起細(xì)胞死亡，給予0.1μmol/L哇巴因干預(yù)24h，細(xì)胞由多角形變?yōu)閳A形，細(xì)胞間縫隙增大，細(xì)胞折光性減弱，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、破碎、死亡。而10μmol/L哇巴因結(jié)合肽與0.1μmol/L哇巴因處理后，細(xì)胞死亡明顯減少。熒光顯微鏡下觀(guān)察證明，10μmol/L哇巴因處理細(xì)胞12h后有90％細(xì)胞劇烈壞死，被PI染成紅色；0.

10、1μmol/L哇巴因組細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，呈亮珠狀，并形成凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，而聯(lián)合組則凋亡細(xì)胞數(shù)量減少。 (6)哇巴因結(jié)合肽與0.1μmol/L哇巴因聯(lián)合對(duì)EAhy926細(xì)胞鈉泵α1和β1亞單位mRNA表達(dá)的影響：聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組與單獨(dú)使用0.1μmol/L哇巴因組作比較，聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組能下調(diào)EAhy926細(xì)胞鈉泵α1亞單位的表達(dá)，上調(diào)β1亞單位表達(dá)，且兩者均呈濃度依賴(lài)性。隨著哇巴因結(jié)合肽濃度的增加，鈉泵α1亞單位mRNA表達(dá)

11、明顯減弱；相反，β1亞單位mRNA表達(dá)增高。 (7)哇巴因結(jié)合肽與0.1μmol/L哇巴因聯(lián)合對(duì)EAhy926細(xì)胞VE-cadherin和Snail基因mRNA表達(dá)的影響：聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組與0.1/μmol/L哇巴因?qū)φ战M比較，哇巴因結(jié)合肽能濃度依賴(lài)性地上調(diào)VE-cadherin表達(dá)、下調(diào)Snail表達(dá)。且二者的表達(dá)存在逆反關(guān)系，Snail在轉(zhuǎn)錄水平抑制VE-cadherin的表達(dá)。 結(jié)論： (1)從噬菌體7肽庫(kù)中得到

12、篩選一致率較高的哇巴因特異性結(jié)合短肽，其堿基序列為：CAACGTACTGGA CGTCCACT，蛋白序列為：RCMTSRS。 (2)哇巴因結(jié)合肽可以阻抑哇巴因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)死亡作用，其作用呈濃度-時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。 (3)哇巴因結(jié)合肽可以阻抑哇巴因所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈉泵α1亞單位和Snail基因的表達(dá)上調(diào)及鈉泵β1亞單位和VE-cadherin的表達(dá)下調(diào)。這些分子的表達(dá)變化在血管內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附中