轉(zhuǎn)天蠶素B及串聯(lián)高M(jìn)et和Lys納豆芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建.pdf

1、抗菌肽是一種具有抗菌生物活性且多為小于10KD的分子多肽，可以直接通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體獲取。其在食品、醫(yī)藥中被廣為應(yīng)用，同時(shí)也被認(rèn)定是一類環(huán)保型飼料添加劑。天蠶素B(Cecropin B)是一種具有熱穩(wěn)定性的成熟小肽，僅含35個(gè)氨基酸，在已獲得的眾多抗菌肽中抗性較強(qiáng)。它對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等有著顯著的抑制殺傷性。
　　蛋氨酸是植物性蛋白中廣為缺失的一種氨基酸，因而增添蛋氨酸于動(dòng)物的日糧中不僅能夠提高植物性蛋白的利用率，還能有效降低飼養(yǎng)動(dòng)物所

2、需飼料的成本。在飼料工業(yè)中，賴氨酸的需求量很大。飼料中添加的賴氨酸主要通過(guò)微生物發(fā)酵或化學(xué)合成的方法獲取。化學(xué)合成賴氨酸的生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)繁雜，副產(chǎn)物較多，不可直接用于添加，且價(jià)格昂貴。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸的生物效率明顯高于化學(xué)合成法，其中益生菌產(chǎn)生的賴氨酸更是綠色、無(wú)污染、安全且能夠直接用作添加劑。
　　益生菌是由一種或多種有益微生物及代謝物構(gòu)成的活菌制劑，人類或動(dòng)物能直接使用和喂食。納豆芽孢桿菌隸屬于益生菌，是枯草芽抱桿菌的一個(gè)

3、亞種，已被納入我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級(jí)微生物添加劑。其作為飼料添加劑能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)、提高畜禽免疫能力和抗應(yīng)激能力等。
　　本實(shí)驗(yàn)利用基因工程方法，獲取了天蠶素B基因(CB)、高蛋氨酸蛋白基因(zein)及高賴氨酸蛋白基因(Cflr)，同時(shí)利用融合PCR技術(shù)將zein、Cflr進(jìn)行了串聯(lián)。將CB基因與串聯(lián)的zein-Cflr基因分別連接至枯草芽孢桿菌的一種表達(dá)載體pHT43，構(gòu)建出pHT43/CB和pHT43/z

4、ein-Cflr重組表達(dá)載體。之后，利用化學(xué)方法制備納豆芽孢桿菌感受態(tài)，將兩種重組載體分別轉(zhuǎn)化至納豆芽孢桿菌中，并驗(yàn)證重組載體在目的菌中穩(wěn)定傳代，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定率均為100％。為了驗(yàn)證此類重組載體對(duì)納豆芽孢桿菌自身的生長(zhǎng)代謝是否有促進(jìn)或抑制作用，測(cè)定了重組菌與野生菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明該質(zhì)粒幾乎對(duì)目的菌無(wú)影響。
　　對(duì)轉(zhuǎn)入pHT43/CB的納豆芽胞桿菌進(jìn)行了抑菌活性的測(cè)定，抑制大腸桿菌的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)于酪乳桿菌的抑菌活性優(yōu)于重組菌，枯草

5、芽孢桿菌和重組菌的抑菌活性均較低，但重組菌的抑菌活性優(yōu)于野生菌的抑菌活性;抑制金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)重組菌的抑菌活性明顯高于干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌及其野生菌。此外，還進(jìn)行了Western-blot的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后有目的蛋白的表達(dá)。
　　對(duì)轉(zhuǎn)入pHT43/zein-Cflr的納豆芽胞桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行了SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在40ku處出現(xiàn)了1條明顯條帶，該值與目的蛋白帶相符。此外，還通過(guò)HPLC檢測(cè)菌株發(fā)