羅布麻、胡楊P5CS基因的克隆及其功能初步分析.pdf

1、干旱脅迫極大影響著植物的生理生化反應(yīng),嚴(yán)重制約著農(nóng)、林、牧業(yè)的產(chǎn)量和種植面積,對(duì)我國農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食安全構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn).在干旱脅迫條件下,植物主要通過滲透調(diào)節(jié)抵抗逆境,脯氨酸是分布最廣的植物內(nèi)源滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一.二氫吡咯-5-羧酸合成酶(△<'1>-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)作為谷氨酸途徑中的關(guān)鍵酶,催化谷氨酸合成P5C,是合成脯氨酸過程的限速酶.而沙生植物生長(zhǎng)在極端干旱的環(huán)境中

2、,具有很強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿、防風(fēng)、固沙、改良土壤等能力.生長(zhǎng)于新疆羅布泊沙漠附近的羅布麻(Apocynum veneturnL)、胡楊(Populus euphratica Oliv),能夠合成并積累大量的滲透脅迫調(diào)節(jié)物質(zhì),對(duì)干旱脅迫具有極強(qiáng)的耐受能力.因此,本研究以羅布麻、胡楊及甘草為研究材料,從中分離克隆新的P5CS基因,以期為P5CS基因在協(xié)助植物抵抗逆境方面的研究提供一定的理論依據(jù),為培育具有穩(wěn)定抗旱耐早性的轉(zhuǎn)P5CS基因的農(nóng)作物

3、、林木及牧草新品系奠定基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下: 1.針對(duì)沙生植物的特點(diǎn),改進(jìn)其RNA提取方法,利用同源克隆的方法克隆了羅布麻、胡楊P5CS基因的同源片段. 2.根據(jù)獲得的羅布麻和胡楊P5CS基因同源片段設(shè)計(jì)特異引物,利用RACE技術(shù)克隆了羅布麻及胡楊的P5CS基因cDNA全長(zhǎng)序列,并命名為Avp5cs和Pep5cs.經(jīng)序列比對(duì)分析表明,Avp5cs基因的核酸序列與番茄(SLU60267)Solanum.lycopersi

4、cum、彩色獼猴桃(ADU92286)Actidiadeliciosa、桐花樹(DQ431113).Aegiceras corniculatum,大豆(AY492005)Glycine max,蒺藜狀苜蓿(AJ278818)Medicago truncatula的P5CS基因同源性達(dá)到75.40﹪;Pep5cs基因的核酸序列與歐洲葡萄(AJ005686)Vitis.vinifera、烏投葉豇豆(VIRPYRR)Vigna aooniti

5、folia、大豆(AY492005)G max、番茄(SL,U60267)S.lycopersicum的PSCS基因同源性達(dá)到77.63﹪. 3.根據(jù)羅布麻及胡楊P5CS基因的特點(diǎn),利用pBI121載體構(gòu)建了植物表達(dá)載體p-Avp5cs和p-Pep5cs,轉(zhuǎn)化煙草:經(jīng)kan抗性篩選及PCR,RT-PCR檢測(cè)獲得了7株轉(zhuǎn)Avp5cs基因的煙草陽性植株. 4.通過繪制脯氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得線性回歸方程,利用分光光度法測(cè)量植物