小鼠Flt3L基因克隆與表達(dá)純化及其生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、目的：獲得小鼠Flt3L(FL)序列，構(gòu)建表達(dá)小鼠FL蛋白的原核表達(dá)載體PGEX-4T3/mFL,并誘導(dǎo)其表達(dá)、純化及鑒定其生物學(xué)活性。
　　 方法：提取C57BL/6小鼠脾臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用小鼠FL序列特異性引物PCR擴(kuò)增FL cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T3/mFL。經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。GST親和層析方法純化目的蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。通過體

2、外培養(yǎng)pDC的方法檢測其生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果：⑴經(jīng)測序證實(shí)，獲得的目的基因與GenBank公布的小鼠Flt3L基因序列(NM_013520.3)的同源性為99%一致，僅第688位堿基不同。NM_013520.3序列該處堿基為T，克隆序列為C。但兩個(gè)序列中，該堿基對應(yīng)的密碼子所編碼的氨基酸均為脯氨酸，屬于同義突變。⑵構(gòu)建的原核表達(dá)載體PGEX-4T3/FL在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出相對分子質(zhì)量為52000的蛋白