山芝麻酸甲酯對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1-Smads信號(hào)通路的調(diào)控作用機(jī)制.pdf

1、目的:肝纖維化（liver fibroisis）是多種原因引起的慢性肝損傷所致的病理改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積，是肝硬化的早期可逆階段。有多項(xiàng)研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellatecells，HSC)的激活在肝纖維化發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，是肝內(nèi)ECM的主要細(xì)胞來源。抑制HSC活化、增殖與減少ECM合成是目前阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。
　　本課題組從山

2、芝麻中分離鑒定出一種三萜化合物，即山芝麻酸甲酯(methyl helicterate，MH)，在前期研究的基礎(chǔ)上，以TGF-β1/Smads信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討山芝麻酸甲酯對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響以及其體外抗纖維化作用機(jī)制。
　　方法:本研究采用的細(xì)胞系包括大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)、人肝星狀細(xì)胞(LX2)、人正常肝細(xì)胞(7702)。將HSC-T6和LX2細(xì)胞分為6組:正常組，TGF-β1刺激組，MH低、中、高劑量組(12.5

3、μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)，陽性對(duì)照組（LY364947組）。7702細(xì)胞分為4組:正常組，MH低、中、高劑量組(12.5、25、50μg/mL)。為了評(píng)價(jià)MH的細(xì)胞毒效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度MH作用于肝星狀細(xì)胞，繼而利用MTT法檢測(cè)MH對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響;此外，細(xì)胞用TGF-β1預(yù)處理30 min后，加入MH繼續(xù)孵育24 h，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量;劃痕實(shí)驗(yàn)觀察MH對(duì)細(xì)胞遷移的影響;AO-E

4、B染色、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期;免疫組化法測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體Ⅰ(TβRⅠ)、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)(Col-Ⅲ)的表達(dá);RT-qPCR法檢測(cè)TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7和纖溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）mRNA的表達(dá);Western blot法檢測(cè)α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TβRⅠ、TβRⅡ和Smad2/3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)

5、 MH對(duì)細(xì)胞增殖和LDH釋放量的影響
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MH在6.25～200μg/mL時(shí)，對(duì)HSC-T6、LX2和7702細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，且呈濃度依賴性;與此相反，TGF-β1刺激后可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)。另外，MH對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖亦具有明顯的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。此外，LDH檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明TGF-β1刺激組細(xì)胞LDH釋放量無明顯改

6、變，當(dāng)MH濃度＞12.5μg/mL時(shí)，作用24 h后，HSC-T6細(xì)胞LDH釋放量明顯增加(P＜0.05)。以上結(jié)果說明MH對(duì)肝星狀細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性作用。
　　(2) MH對(duì)細(xì)胞遷移、凋亡及細(xì)胞周期的影響
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，TGF-β1刺激組細(xì)胞遷移明顯加快，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及周期則無明顯變化。MH（12.5、25和50μg/mL）作用24 h后，細(xì)胞遷移受到抑制，遷移速度減慢;凋亡實(shí)驗(yàn)表明，MH可引起細(xì)胞

7、凋亡增多，且呈藥物濃度依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)，MH誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2期。這些結(jié)果提示，MH可能是通過抑制肝星狀細(xì)胞的活化、促進(jìn)其凋亡，而起到抗肝纖維化的作用。
　　(3) MH對(duì)α-SMA和膠原的影響
　　免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，TGF-β1刺激組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，給予MH干預(yù)后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)被明顯抑制(P＜0.01);類似

8、的，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明TGF-β1可提高α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)，而MH能下調(diào)α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01）。提示，MH能抑制膠原的生成，減少ECM的過度沉積，這可能是其發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥理學(xué)基礎(chǔ)。
　　(4) MH對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，TGF-β1刺激組TβRⅠ、TβRⅡ、Sm

9、ad2、Smad3和PAI-1 mRNA的表達(dá)顯著提高(P＜0.05或P＜0.01)，而MH治療組與LY364947陽性對(duì)照組的這些組基因mRNA的表達(dá)明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。另外，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3蛋白的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01);給予MH或LY364947干預(yù)后能明顯逆轉(zhuǎn)這些蛋白的異常表達(dá)。提示，MH抑制肝星狀細(xì)胞活化的作用可能與阻