多倍體魚轉(zhuǎn)座子的遺傳變異和雌核發(fā)育魚性腺發(fā)育的分子生物學(xué)研究.pdf

1、基因組內(nèi)獨(dú)立的DNA序列的轉(zhuǎn)座子（transposons），在物種進(jìn)化過程中有重要的作用。它能夠從一個(gè)位置轉(zhuǎn)出，然后插入到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子通過轉(zhuǎn)出和插入方式，改變生物基因組或基因結(jié)構(gòu)，為生物多態(tài)性和物種分化提供了重要來源。對轉(zhuǎn)座子的研究除能揭示其結(jié)構(gòu)和功能外，還在物種的起源和進(jìn)化、基因組的多態(tài)性，以及基因順次表達(dá)調(diào)控等方面具有重要意義。紅鯽（♀）（Carassius auratus red var）和團(tuán)頭魴（♂）（Megalobram

2、a amblycephala）亞科間的遠(yuǎn)緣雜交，成功的培育出了三倍體鯽魴和四倍體鯽魴。本文研究了四倍體鯽魴、三倍體鯽魴、紅鯽和團(tuán)頭魴基因組內(nèi)DNA轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)座子Tcl的分子結(jié)構(gòu)和遺傳特征；比較研究了不同倍性魚中高遷移率族蛋白編碼基因核苷酸和氨基酸序列的相似性，探討了該蛋白與DNA轉(zhuǎn)座子相互作用的關(guān)系；基于多倍化的異源四倍體鯽鯉、通過雌核發(fā)育技術(shù)、構(gòu)建的二倍體雜交克隆系平臺，利用抑制性消減雜交技術(shù)，研究了二倍體雜交魚形成二倍體卵子

3、的分子機(jī)制。本論文的主要研究內(nèi)容如下： 1、利用流式細(xì)胞儀技術(shù)，測定了團(tuán)頭魴單倍體基因組大小為1.55pg（1438 Mb），該基因組中檢測到一種新的DNA轉(zhuǎn)座子，命名為Tmal，該轉(zhuǎn)座子屬于TCI家族的第3群。斑點(diǎn)雜交檢測，其在團(tuán)頭魴基因組中具有670個(gè)考貝，并經(jīng)Southern blot雜交驗(yàn)證。Tmal推測的轉(zhuǎn)座酶氨基酸序，經(jīng)與分子重組恢復(fù)活性的鮭科魚類轉(zhuǎn)座子比對，發(fā)現(xiàn)具有一個(gè)類似配對的鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)、一個(gè)類GRR的AT錨定

4、基序，以及雙價(jià)核定位信號。由于Tmal序列已積累了多個(gè)內(nèi)部終止子，表明Tmal已在宿主內(nèi)失去轉(zhuǎn)座活性。這是首次報(bào)道了團(tuán)頭魴基因組中的DNA轉(zhuǎn)座子。 2、以團(tuán)頭魴為父本、紅鯽為母本的遠(yuǎn)源雜交，導(dǎo)致父本Tmal從雜交后代四倍體鯽魴基因組中完全切離，而在雜交后代三倍體鯽魴基因組中，Tmal序列僅發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和插入突變，表明在遠(yuǎn)源雜交過程中，轉(zhuǎn)座子具有2種分子遺傳變異方式：（1）垂直失活，轉(zhuǎn)座子以點(diǎn)突變的方式積累突變；（2）隨機(jī)丟失，

5、轉(zhuǎn)座子以切除方式脫離于雜交后代基因組。 3、通過PCR方法，在4nRB基因組中檢測到一種新的轉(zhuǎn)座子，命名為Ttel，屬于TC1家族的第1群。斑點(diǎn)雜交檢測，在大小為1.76 pg的四倍體鯽魴基因組中，該轉(zhuǎn)座子具有880個(gè)拷貝數(shù)。本研究首次報(bào)道了脊椎動(dòng)物遠(yuǎn)源雜交導(dǎo)致了轉(zhuǎn)座子迸發(fā)。 4、利用RACE技術(shù)，獲得了三倍體鯽魴、四倍體鯽魴、紅鯽和團(tuán)頭魴的高遷移率族蛋白1基因mRNA全長序列，其開放閱讀框包含579nt，翻譯成19

6、3個(gè)氨基酸。序列比較分析表明：核苷酸水平上，四倍體鯽魴與母本紅鯽的同源性（99％）高于同父本團(tuán)頭魴的同源性（97％），三倍體鯽魴與父母本同源性（95％）低于親本之間的同源性（98％）；氨基酸水平上，四倍體鯽魴與父母本的同源性（100％）高于三倍體鯽魴與雙親的同源性（97％）。結(jié)果表明：遠(yuǎn)源物種間的雜交對兩性不育的三倍體鯽魴HMG1基因造成了一定的沖擊，分子遺傳效應(yīng)表現(xiàn)為三倍體鯽魴HMG1基因位點(diǎn)發(fā)生了變異；四倍體鯽魴HMG1氨基酸序列與

7、雙本的完全一致性，克服了等位基因的雜交不親和性，為兩性可育的異源四倍體鯽魴遺傳穩(wěn)定奠定了基礎(chǔ)。 5、采用抑制性消減雜交技術(shù)，異源四倍體鯽鯉雌核發(fā)育第3代（G3）卵巢生長期cDNA為驅(qū)動(dòng)方，第4代（G4）卵巢增殖期cDNA為檢測方，構(gòu)建了一個(gè)正向消減cDNA文庫。通過斑點(diǎn)雜交篩選文庫，獲得了73個(gè)特異于G4表達(dá)的克隆，對其中部分克隆進(jìn)行了測序。BLASTX搜索結(jié)果表明，一些克隆cDNA推測的編碼蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知序列具有

8、明顯的同源性。這些蛋白包括：信號識別顆粒9蛋白，ATP—連接盒轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，葡聚糖—葡萄糖融合蛋白，阻止有絲分裂細(xì)胞凋亡蛋白等。通過反轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT—PCR）證實(shí)上述編碼蛋白基因在卵巢增殖期上調(diào)表達(dá)。這些基因的鑒定，為研究鯽鯉雜交二倍體魚的卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 6、通過定量RT—PCR（Quantitative Real～time PCR），分析了編碼阻止有絲分裂細(xì)胞凋亡蛋白基因（PMC）的表達(dá)變化，在