雌核發(fā)育雙單倍體牙鲆(Paralichthys olivaceus)的純合性鑒定和性腺的組織學(xué)觀察.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國沿海岸分布的重要經(jīng)濟(jì)魚類，在日本、韓國沿海也有分布。牙鲆個體碩大、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值很高，同時具有一定的藥用價值，因而擁有廣闊的市場。但由于過度捕撈和環(huán)境污染，造成自然資源大幅度衰減，供需矛盾較大，促使牙鲆人工養(yǎng)殖得到迅速的發(fā)展。由于牙鲆雌、雄性的生長差異，牙鲆的全雌化養(yǎng)殖成為研究的熱點(diǎn)。
　　 雌核發(fā)育，根據(jù)處理原理的不同，可分為減數(shù)分裂雌核發(fā)育和有絲分裂雌核發(fā)育。魚類

2、的有絲分裂雌核發(fā)育能夠產(chǎn)生純合后代，即雌核發(fā)育雙單倍體(Doubled Haploid，DH)。利用完全純合的DH再次誘導(dǎo)雌核發(fā)育，可以獲得克隆魚。DH及其克隆系的純合特性，決定了其在遺傳和基因組研究以及魚類育種方面，具有巨大的研究和應(yīng)用價值。但由于DH的孵化率很低，成活率也不高，研究材料及其珍貴，故其性腺組織學(xué)研究還未見報(bào)道。本文利用微衛(wèi)星標(biāo)記方法對DH牙鲆進(jìn)行了純合性鑒定，并對其性腺進(jìn)行了組織學(xué)觀察，對其性比及性腺組織學(xué)特征進(jìn)行了描

3、述與分析，以期深入了解DH魚類的生物學(xué)特征。
　　 通過紫外線照射真鯛(Pagrosomus major)精液，利用滅活的精子激活牙鲆的卵子，誘導(dǎo)牙鲆有絲分裂雌核發(fā)育。激活后的卵子靜置3 min后加入17℃海水培育60 min，然后轉(zhuǎn)移至靜水壓力機(jī)中，施加壓力650 kg/cm2，持續(xù)6 min，完成雌核發(fā)育誘導(dǎo)后，移至常溫海水中孵化，之后在水泥池內(nèi)培育2年，獲得試驗(yàn)樣本129尾。
　　 根據(jù)Genebank上公布的以及

4、EST-SSR方法尋找微衛(wèi)星標(biāo)記，根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記設(shè)計(jì)引物，之后利用牙鲆親本基因組DNA對微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選出的20個標(biāo)記用于試驗(yàn)群體的純合性鑒定:結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這一群體的20個位點(diǎn)都是純合的，純合度很高，標(biāo)記的分型結(jié)果可以用于基因連鎖圖譜的構(gòu)建。
　　 組織學(xué)切片結(jié)果顯示，在129尾樣本中，雌性88尾，占試驗(yàn)群體總數(shù)的68％;雄性37尾，占試驗(yàn)群體總數(shù)的29％;無法區(qū)分雌雄的4尾，占試驗(yàn)群體總數(shù)的3％，雌雄比例約為1∶0

5、.42;對照組普通牙鲆的雌雄性比為55∶45，接近1∶1。
　　 DH的卵巢發(fā)育階段基本一致，處于Ⅱ期。少數(shù)DH的卵巢發(fā)育正常，多數(shù)卵巢的卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在胞核和胞質(zhì)中都有體現(xiàn)，呈畸形發(fā)育，根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為7種類型。對照組卵巢發(fā)育至Ⅲ期，與對照組相比，DH的卵巢發(fā)育較遲緩。根據(jù)正常發(fā)育卵母細(xì)胞所占比例，定義正常卵母細(xì)胞比例在50％以上的卵巢為發(fā)育正常卵巢，少于50％的為發(fā)育異常卵巢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有82尾DH牙鲆的卵巢發(fā)育不正

6、常，說明DH家系的雌性不育或者繁殖力低下。
　　 DH的精巢發(fā)育多停滯在Ⅱ期，精原細(xì)胞成簇分布于精小囊內(nèi)，精小囊無腔隙，小葉間有結(jié)締組織，精原細(xì)胞在小葉間成群排列，未有進(jìn)一步的分化，說明雄性是不育的。少數(shù)精巢發(fā)育正常并具有精子，但與對照組精巢結(jié)構(gòu):精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及精子等相比，結(jié)構(gòu)上有差異，精原細(xì)胞部分愈合，其它精細(xì)胞也較少。
　　 在DH的卵巢中觀察到卵黃核的解聚過程，可能與脂肪的形成有