力生長因子對骨髓間充質干細胞的生物學作用及機制研究.pdf

1、骨髓間充質干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）是一類具有多向分化潛能（Multiple differentiation potentiality）的成體干細胞，能向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞以及肌細胞等方向進行分化。因其具有取材方便、增殖快速、低免疫原反應、能夠分化為多種細胞、分泌多種生物活性因子以及向損傷組織遷移等優(yōu)點，目前成為細胞、基因治療以及組織工

2、程等領域方面的研究熱點。
　　在細胞治療和組織修復的研究中，BMSCs的誘導分化顯得尤為重要。BMSCs處于復雜的流體微環(huán)境中，許多研究證明力學因素在BMSCs的分化過程中起著重要的作用。力生長因子（Mechano-growth factor,MGF）是近年來新發(fā)現(xiàn)的組織受損或受力學刺激過程中表達的一種胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor,IGF-1）選擇性剪接變體。實驗證明MGF及MGF E結構

3、域24肽（羧基端24肽，MGF-E）在保護受損組織和細胞、促進損傷修復方面起重要的作用。目前，已有關于MGF在細胞分化方面的研究，但MGF在人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的分化過程中起著怎樣的作用尚不清楚。
　　本文首先研究了MGF-E對hBMSCs增殖和遷移的影響，在此基礎上著重研究MGF及MGF-E對hBMSCs分化的影響，繼而研究何種因素在MGF-E誘導hBMSCs的分化過程中起主要調控作用。本文的主要工作和研究結果如下

4、：
　?、費GF-E對hBMSCs增殖和遷移的影響
　　首先，通過可控的FX-4000T細胞應力加載系統(tǒng)對hBMSCs施加12％，1Hz的等雙軸周期性力學刺激，利用Real time RT-PCR（Real time Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction）技術檢測MGF-E的表達。結果顯示，力學加載并未對MGF-E基因的表達產生影響。隨后，檢測外源性添加MGF-E對h

5、BMSCs細胞增殖和遷移的影響。結果顯示MGF-E對細胞的增殖速率具有一定的延緩作用。Transwell和創(chuàng)傷愈合實驗檢測顯示25ng/mL和50ng/mL的MGF-E能明顯促進細胞的遷移，100ng/mL的 MGF-E與對照組相比細胞的遷移沒有明顯變化。RT-PCR與Western blot實驗結果顯示MGF能促進環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）mRNA和蛋白的表達，COX-2抑制劑NS-398能延緩MGF

6、誘導的細胞遷移速率，說明MGF可能通過誘導COX-2的表達促進hBMSCs的遷移。以上實驗結果表明力學加載并未對hBMSCs中MGF的表達產生影響；外源性添加MGF-E能促進細胞的遷移，延緩細胞的增殖速率。
　?、贛GF-E對hBMSCs向成骨、成脂肪及成軟骨方向分化的影響
　　為研究MGF-E對hBMSCs分化的作用，分別配制成骨、成脂肪及成軟骨誘導分化培養(yǎng)基并作為對照組，以加入20ng/mL MGF-E的誘導分化培養(yǎng)基為

7、實驗組，分別進行了成骨、成脂肪及成軟骨方向分化的檢測。培養(yǎng)過程中誘導分化培養(yǎng)基每三天更換一次，MGF-E每天添加一次。實驗結果如下：
　　1）通過堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）活性檢測，ALP染色和茜素紅染色（Alizarin Red S staining）研究了MGF-E在hBMSCs向成骨分化中的作用。
　　2）通過油紅O（Oil Red O）染色以及RT-PCR技術研究了MGF-E在hB

8、MSCs向成脂肪分化中的作用。
　　3）通過免疫熒光染色及酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技術研究MGF-E在hBMSCs向成軟骨方向分化中的作用。
　　以上實驗的研究結果表明分別向成骨、成脂肪、成軟骨分化誘導培養(yǎng)基中添加MGF-E能顯著促進hBMSCs向成骨、成脂肪、成軟骨方向分化，這為后續(xù)的研究提供了基礎依據(jù)。
　?、圻^表達MGF對hBMSCs向成

9、骨及成脂肪方向分化的影響
　　為進一步研究MGF在hBMSCs分化中的作用，由Invitrogen公司構建含有MGF基因的質粒，轉入大腸桿菌中擴增，隨后轉染到hBMSCs中。將轉染MGF基因的hBMSCs分別在成骨分化誘導培養(yǎng)基和成脂肪分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以空白質粒為對照，分別進行茜素紅和油紅O組織化學染色。RT-PCR實驗結果顯示轉染后的hBMSCs中MGF的表達明顯升高。成骨誘導分化培養(yǎng)7天后，茜素紅染色顯示誘導后的細胞產生

10、大量鈣沉積；成脂肪誘導分化培養(yǎng)7天后，油紅O染色結果顯示誘導后的細胞含有較多的脂肪油滴。以上實驗結果表明MGF轉染后的hBMSCs分別在成骨、成脂肪分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)后其向成骨、成脂肪細胞分化的能力明顯增強。
　?、躆GF-E通過延遲細胞周期促進 hBMSCs的分化
　　為研究MGF-E誘導hBMSCs分化的調節(jié)機制，利用流式細胞技術（Flow cytometry assay）檢測MGF-E對細胞周期的影響，并通過RT-P

11、CR技術檢測相關周期蛋白Cyclin E和cyclin-dependent kinase（CDK2）的表達情況。流式檢測結果顯示生長培養(yǎng)基中添加MGF-E24小時后，G1期細胞數(shù)量明顯增加，說明MGF-E將細胞周期阻滯在G1期，G1期時間延長。RT-PCR結果顯示MGF-E處理24小時后細胞周期蛋白Cyclin E、CDK2 mRNA表達水平明顯下降。以上實驗結果表明MGF-E可能通過減少細胞周期蛋白Cyclin E、CDK2的表達，將