植物雌激素保護(hù)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷代謝組學(xué)研究.pdf

1、阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是以認(rèn)知障礙和人格改變?yōu)榕R床特征的神經(jīng)退行性疾病。目前，其發(fā)病原因尚不明確，缺乏有效治療手段。調(diào)查結(jié)果顯示，老年女性AD的發(fā)病率明顯高于男性，提示雌激素的缺失可能影響中樞神經(jīng)的相關(guān)功能，大量研究表明雌激素具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠防治AD，但副作限制其廣泛應(yīng)用。植物雌激素（Phytoestrogen，PE）來(lái)源于天然植物，不僅具有雌激素樣作用的雙向調(diào)節(jié)，而且還具有良好的安全性

2、。有望成為人工合成雌激素的替代物，用于AD的臨床治療。柚皮苷和山柰酚是具有植物雌激素活性的藥物，故本實(shí)驗(yàn)選用柚皮苷及山柰酚為受試藥物，探討植物雌激素對(duì)AD的影響。
　　目的：
　　本文用Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞建立AD體外細(xì)胞模型，以具有植物雌激素活性藥物-柚皮苷和山柰酚為受試藥物，采用GC-MS細(xì)胞代謝組學(xué)方法，分析給藥前后AD細(xì)胞模型的內(nèi)源性代謝物變化，找出潛在生物標(biāo)記物，闡明山柰酚和柚皮苷保護(hù)神經(jīng)損傷的作用機(jī)制

3、。
　　方法：
　　1.采用不同濃度的Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定最佳損傷濃度，建立AD體外細(xì)胞模型。
　　2.以鹽酸多奈哌齊和雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)柚皮苷和山柰酚對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3.將PC12細(xì)胞樣品進(jìn)行硅烷化柱前衍生化處理，對(duì)樣品處理過(guò)程中的淬滅方法、破碎方法、提取劑、肟化條件、衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳條件，建立PC

4、12細(xì)胞代謝產(chǎn)物的GC-MS分析方法，獲得穩(wěn)定的PC12細(xì)胞代謝物譜。
　　4.將空白組、模型組和藥物干預(yù)組的PC12細(xì)胞代謝物譜分別利用NIST05a標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索，對(duì)PC12細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。采用MZmine將得到的質(zhì)譜信息轉(zhuǎn)化為可供分析的數(shù)據(jù)，利用SIMCA-P12.0對(duì)內(nèi)源性代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA模式識(shí)別、PLS-DA分析，挖掘潛在的生物標(biāo)記物，并利用SPSS11.5對(duì)潛在生物標(biāo)記物的相對(duì)峰面積進(jìn)行t檢驗(yàn)分

5、析，觀察空白組、模型組和藥物干預(yù)組潛在生物標(biāo)記物的趨勢(shì)變化。采用生物化學(xué)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找差異性代謝物的代謝通路，構(gòu)建與神經(jīng)保護(hù)作用之間的聯(lián)系，深入解釋柚皮苷和山柰酚抗AD的作用機(jī)制
　　結(jié)果：
　　1.與空白組比較，20μM Aβ25-35（P＜0.01）作用PC12細(xì)胞24h以后，可作為AD早期病理?yè)p害的細(xì)胞模型。
　　2.與模型組（Aβ?lián)p傷組）比較，10-1μM的山柰酚（P

6、＜0.01）和10-1μM的柚皮苷（P＜0.01）對(duì)Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。
　　3.通過(guò)比較峰面積和峰個(gè)數(shù)，得出最佳樣品處理方法為：細(xì)胞進(jìn)行液氮淬滅，提取劑為1.5mL乙腈-水（4：1，V/V），破碎條件為用超聲細(xì)胞破碎。此方法共檢測(cè)出方法共檢測(cè)出524個(gè)PC12細(xì)胞代謝物。
　　4.GC-MS分析方法建立了穩(wěn)定的PC12細(xì)胞代謝物譜，利用SIMCA-P12.0對(duì)內(nèi)源性代謝物進(jìn)行PCA模式識(shí)別、

7、PLS-DA分析。結(jié)果確定了27種潛在生物標(biāo)記物：甘氨酸、乙酰胺、乳酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、磷酸、氨基丙二酸、脯氨酸、D-蘋(píng)果酸、L-絲氨酸、苯丙氨酸、α-酮戊二酸、1.4-丁二胺、檸檬酸、3-羧基丁酸、亮氨酸、L-蘇氨酸、肌醇、肌醇、乙酸、硬脂酸、膽固醇、棕櫚酸、尿苷、α-D-吡喃葡萄糖、油酸酰胺、核糖磷酸。這27種潛在生物標(biāo)記物所在的代謝通路如下：（1）甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸代謝；（2）丙氨酸，天門(mén)冬氨酸和谷氨酸的代謝；（3）脂