季節(jié)性H3N2流感PB1-F2分子流行病學(xué)監(jiān)測和功能初步探討.pdf

1、目的：
　　H3N2流感亞型是季節(jié)性流感中最主要的亞型，相較于H1N1(09pdm)、B型流感具有罹患率高、重癥比例高、死亡人數(shù)多的特點(diǎn)，是影響人類健康的重要病原體之一。流感病毒第11個蛋白PB1-F2，被認(rèn)為是流感病毒感染宿主過程中的重要毒力因子，具有影響病毒的復(fù)制能力、促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡以及引起繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎等功能。本研究對流感病毒PB1-F2蛋白進(jìn)化趨勢和遺傳特征進(jìn)行分析，結(jié)合江蘇省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測系統(tǒng)分析江蘇省2012年-2

2、015年101株H3N2流感病毒流行株P(guān)B1-F2蛋白遺傳進(jìn)化規(guī)律，掌握PB1-F2蛋白的動態(tài)進(jìn)化趨勢。為進(jìn)一步了解H3N2亞型PB1-F2蛋白長度多態(tài)性對其功能特征的影響，本研究還展開對H3N2亞型全長型和截短型PB1-F2病毒毒力、致病性和細(xì)胞因子變化的初步探討。此外本研究還為后續(xù)深入研究PB1-F2全長型和截短型蛋白功能差異建立流感病毒反向遺傳體系，為拯救突變流感毒株、繼續(xù)探討其生物學(xué)功能奠定堅實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　方法：

3、r>　　1.利用NCBI流感數(shù)據(jù)庫下載全球人、禽和株流感病毒PB1-F2蛋白相關(guān)信息和核苷酸序列，PB1-F2斷裂數(shù)據(jù)集利用Excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，核苷酸序列、氨基酸序列使用MEGA6.0.6、DNA Sequence Polymorphism5.1、Fasttree等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行PB1-F2基因分子進(jìn)化分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。
　　2.江蘇省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)甲型H3N2流感毒株101株，利用Con

4、tingExpress Aplication軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，得到PB1核苷酸序列，采用MEGA6.0.6軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(ClustalW法)，對PB1及PB1-F2氨基酸位點(diǎn)的改變進(jìn)行分析，利用Fasttree軟件繪制PB1基因編碼區(qū)核苷酸序列的進(jìn)化樹。使用在線工具Datamonkey(http:/www.datamonkey.org)對PB1節(jié)段進(jìn)行選擇壓力分析。
　　3.選擇PB1-F2蛋白斷裂株F1345

5、和全長株S1238感染MDCK和A549細(xì)胞，利用酶聯(lián)免疫法檢測流感病毒感染MDCK細(xì)胞過程中復(fù)制能力差異，MTT法用以檢測PB1-F2蛋白斷裂與否對細(xì)胞凋亡的影響，RT-PCR法檢測A549細(xì)胞受感染后細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)水平。
　　4.定點(diǎn)突變PB1-F2蛋白斷裂株F1345毒株P(guān)B1-F2終止密碼子TAA為CAA，利用8質(zhì)粒系統(tǒng)拯救F1345突變株（全長型PB1-F2）建立反向遺傳體系。
　　結(jié)果：
　　1.

6、PB1-F2蛋白斷裂株分布: GeneBank流感數(shù)據(jù)庫中下載宿主為人類、禽類和豬的流感病毒，PB1-F2蛋白分離率為24.35％，其中人H1N1亞型PB1-F2蛋白自1948年后幾乎全部為斷裂型PB1-F2毒株。人H3N2亞型于1996年發(fā)現(xiàn)PB1-F2蛋白斷裂株，占10.07％，且分離率呈上升趨勢。禽流感病毒斷裂株比例最低為6.47％。
　　2.PB1-F2蛋白遺傳特征和系統(tǒng)發(fā)育樹:H3N2和H1N1亞型流感病毒PB1-F2基

7、因核苷酸同源性分別為97.02％～100％、79.20％～100％。H1N1亞型PB1-F2基因轉(zhuǎn)換與顛換比率最低為3.86。人流感H3N2和H1N2平均多態(tài)性位點(diǎn)比和平均進(jìn)化距離分別0.0705和0.0347，季節(jié)性人H1N1流感亞型平均多態(tài)性位點(diǎn)和平均進(jìn)化距離為0.0733和0.0609，相比人流感H3N2和H1N2亞型病毒其平均遺傳距離較小。各亞型PB1-F2基因非同一突變和同義突變(dN/dS)均大于1。PB1-F2位于PB1基

8、因，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可大致分為7個進(jìn)化分支，分支Ⅰ為人H3N2和H1N2亞型，分支Ⅱ?yàn)樨iH1N1、H3N2、H1N2亞型，分支Ⅲ為人H2N2亞型，分支Ⅳ和Ⅴ為禽流感毒株，其中分支Ⅳ主要來源于美洲和大洋洲，分支Ⅴ主要為亞歐地區(qū)毒株;分支Ⅵ為豬流感，主要為分離自歐洲國家和地區(qū)的甲型H1N1和H3N2流感亞型;分支Ⅶ為人H1N1流感病毒。
　　3.江蘇省H3N2流感毒株P(guān)B1-F2基因監(jiān)測:193株H3N2流感病毒總體上分為4個分支，江蘇

9、省H3N2亞型分離毒株以及2002-2015年分離毒株位于第Ⅳ分支上，1968-1994年分離毒株位于第Ⅱ和Ⅲ分支;分子特征顯示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后發(fā)生適應(yīng)性改變，替換了原來的氨基酸;PB1-F2基因編碼截斷型蛋白長度有52aa、34aa、25aa、24aa、11aa(豬源)，PB1-F2蛋白毒力關(guān)鍵位點(diǎn)上未出現(xiàn)高致病性特征突變。
　　4.PB1-F2蛋

10、白斷裂進(jìn)化特征的功能改變:F1345（PB1-F2截短型）和S1238(PB1-F2全長型)在感染MDCK細(xì)胞后，兩類病毒導(dǎo)致細(xì)胞死亡的數(shù)量隨時間呈現(xiàn)遞減趨勢，其中S1238感染細(xì)胞后，細(xì)胞存活率低于F1345毒株(P=0.0906)。S1238在感染12h-36h之間病毒的復(fù)制能力要高于F1345毒株，36h之后F1345毒株復(fù)制能力明顯上升，各時間點(diǎn)S1238和F1345毒株的吸光度值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR檢測F1345和

11、S1238兩毒株感染后A549細(xì)胞炎癥因子和趨化因子（IL-6、IL-8、IFNα、IFNβ、IFNγ、MCP-1）的mRNA相對表達(dá)水平，IL-8在感染8h后相對表達(dá)水平最高，IFNα/β在感染32h后表達(dá)水平顯著上升，除MCP-1外PB1-F2斷裂株和全長株細(xì)胞因子表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.流感病毒反向遺傳體系建立:基因突變F1345（PB1-F2截短型）PB1-F2開放閱讀框內(nèi)T76C，終止密碼子TAA突變?yōu)楣劝滨０?/p>

12、CAA。構(gòu)建PHW2000-PB1(WT)、PHW2000-PB2、PHW2000-PA、PHW2000-HA、PHW2000-NA、PHW2000-M、PHW2000-NP、PHW2000-NS8個內(nèi)部基因雙向逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)粒和1個突變株P(guān)B1基因質(zhì)粒PHW2000-PB1(MU)，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞與MDCK混合培養(yǎng)細(xì)胞拯救野生斷裂型PB1-F2毒株A/Nanjing/1655/2010(H3N2)和突變?nèi)L型PB1-F2毒株F134

13、5(MU)，建立流感病毒反向遺傳系統(tǒng)，為后續(xù)探討流感病毒PB1-F2蛋白變異與功能的機(jī)制研究奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1.季節(jié)性人流感病毒H3N2亞型PB1-F2蛋白斷裂株比例逐年上升，進(jìn)化速率呈現(xiàn)緩慢而穩(wěn)定的變化規(guī)律，H3N2亞型PB1-F2截短型病毒逐漸成為一種進(jìn)化趨勢。
　　2.2012-2015年江蘇省PB1-F2基因高度集中于同一進(jìn)化分支上，同全國H3N2亞型PB1-F2進(jìn)化趨勢保持一致，且未發(fā)現(xiàn)江

14、蘇省分離毒株P(guān)B1-F2蛋白氨基酸出現(xiàn)高致病性特征突變。
　　3.F1345和S1238毒株P(guān)B1-F2蛋白的長度多態(tài)性引起病毒在細(xì)胞中增殖能力改變，全長型復(fù)制能力高于斷裂型毒株，而在引起細(xì)胞凋亡方面尚未發(fā)現(xiàn)顯著差異性。
　　4.PB1-F2蛋白截短株和全長株引起A549細(xì)胞因子變化主要反應(yīng)在MCP-1趨化因子上。但還尚不能明確地認(rèn)為PB1-F2蛋白斷裂對流感病毒細(xì)胞因子變化的影響，主要原因是實(shí)驗(yàn)中采用的流感毒株雖經(jīng)過基因測