中國東部PCV2分子流行病學與PCVD亞單位疫苗抗原分子研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的又一種新的重要傳染病，主要臨床表現(xiàn)包括：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征( PDNS)、豬呼吸道復合體病和繁殖障礙等。其中，PMWS對全球養(yǎng)豬業(yè)影響巨大，主要發(fā)生于5-12周齡豬，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為衰竭、淋巴結(jié)腫大、呼吸困難、貧血、腹瀉，黃疸和皮膚蒼白，并出現(xiàn)免疫抑制，易發(fā)生多病原混合感染，加劇臨床癥狀。
　　 PCV2是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的重要成員

2、，無囊膜?；蚪M為單股環(huán)狀DNA，全長1767或1768nt，含3個主要閱讀框：ORF1、ORF2和ORF3．ORF1編碼病毒復制相關(guān)蛋白；ORF2編碼病毒衣殼蛋白——Cap蛋白，包含多個線性B細胞表位和中和表位，能夠誘導保護性免疫反應；ORF3編碼的蛋白與病毒誘導的細胞凋亡有關(guān)。PCV2可以分為2個大的基因型：PCV2a和PCV2b。PCV2a包括2A-2E五個亞型；PCV2b包含1A、1B、1C亞型。很多國家地區(qū)都已發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因型的

3、飄移，且認為PCV2b比PCV2a毒力更強。
　　 疫苗免疫是預防PCVD的有效手段。國內(nèi)外商品化疫苗主要有滅活疫苗、桿狀病毒Cap蛋白重組亞單位疫苗和PCV1-PCV2嵌合病毒滅活疫苗。本研究對我國東部31株P(guān)CV2全基因序列進行了分析，明確了PCV2分子流行病學特征；利用大腸桿菌表達系統(tǒng)分析了Cap蛋白不同截斷表達產(chǎn)物的抗原特性；構(gòu)建了融合表達Cap蛋白和生長抑素的重組大腸桿菌和桿狀病毒，并分別進行了免疫特性測定，為PCV2

4、基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。本研究具體內(nèi)容如下：
　　 1．中國東部PCV2分子流行病學調(diào)查通過臨床病料的檢測，PMWS的確診，病毒分離，擴增獲得2001-2009年間從中國東部11個省份發(fā)病豬場分離到的31株P(guān)CV2全基因序列，將其與已公布的另105株中國東部分離株的序列進行比對和進化分析．結(jié)果表明這些毒株分屬PCV2b和PCV2a兩個型，其中PCV2b中有108株屬1A/1B亞型，19株屬1C亞型；PCV2a中有1株屬2A亞

5、型，2株屬2D亞型，6株屬2E亞型。在9個PCV2a型毒株中，有8個分離自2005年之前。此外，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)：在Cap蛋白的53-91、121-151和190-210位氨基酸存在三個高度變異區(qū)；每種亞型具有某些特有的氨基酸變異模式；Cap蛋白上存在一些變異的或保守的抗原表位；同時在自然條件下存在不同基因型間的重組。以上研究結(jié)果說明在2001-2009年中國東部地區(qū)PCV2流行毒株存在PCV2a和PCV2b兩個基因型，同時存在由PC

6、V2a向PCV2b的漂移現(xiàn)象，這為中國豬圓環(huán)病毒病的防控提供了依據(jù)。
　　 2．豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白截斷表達及其抗原特性研究分別擴增五段不同長度的Cap蛋白基因克隆入原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白得到成功表達（Cap-A:51-150aa、Cap-B:51-200aa、Cap-C:51-234aa、Cap-D:101-200aa、Cap-E:101-234aa）。

7、系統(tǒng)的研究不同大小的Cap蛋白亞單位在抗原性方面的差異：將純化的5個重組蛋白分別包被酶標板，利用14份IFA陰性血清和10份IFA陽性血清進行ELISA試驗，結(jié)果為第51-234aa片段(Cap-C)抗原包被組S/N值高于其它4個片段抗原組。將5個重組蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，檢測其抗體產(chǎn)生動態(tài)，發(fā)現(xiàn)Cap-C組誘導的抗體水平最高，而Cap-D誘導的反應最弱。本研究結(jié)果表明，Cap-C抗原反應原性和免疫原性高于其它重組截斷蛋白，為P

8、CV2 ELISA抗體檢測方法和亞單位疫苗研制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 3．豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達重組亞單位疫苗免疫保護效力研究在篩選獲得大腸桿菌表達產(chǎn)物Cap-C蛋白具有較好免疫原性基礎(chǔ)上，采用ISA206和CP940等4種佐劑配制疫苗，小鼠免疫試驗結(jié)果表明，與不加佐劑抗原對照組相比，4種佐劑均可有效提高Cap重組蛋白誘導的ELISA抗體水平（P>0.05）。采用CP940水佐劑Cap重組亞單位疫苗PCV2滅活疫苗進行

9、豬體免疫保護試驗，結(jié)果為：該疫苗經(jīng)兩次免疫可誘導豬體產(chǎn)生較高的ELISA抗體；攻毒后Cap-C免疫組豬和滅活疫苗免疫組豬僅出現(xiàn)短時間的發(fā)熱，無明顯臨床癥狀，相對日增重與空白對照相似（P>0.05），但明顯高于攻毒對照組(P<0．05)。兩免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學變化方面相似，但明顯輕于攻毒對照組。該研究結(jié)果表明，大腸桿菌表達的Cap重組亞單位疫苗對PCV2感染具有較好免疫保護作用，有望成為防控PCV2所致相關(guān)疾病的新型候

10、選疫苗。
　　 4．表達豬圓環(huán)病毒2型Cap-生長抑素融合蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定VLPs疫苗是一類新的亞單位疫苗，具有全病毒的結(jié)構(gòu)又不合核酸，更加安全有效，而且它可以作為外源抗原片段或表位的載體，構(gòu)建嵌合疫苗。桿狀病毒表達系統(tǒng)是生產(chǎn)VLPs的常用工具，已有報道經(jīng)此系統(tǒng)表達的PCV2 Cap蛋白可以形成VLPs;生長抑素(SS)是十四個氨基酸的小肽，與下丘腦生長激素釋放因子( GHRF)共同調(diào)節(jié)生長激素(GH)的釋放，研究表

11、明通過與載體蛋白融合表達，主動免疫動物，可使機體產(chǎn)生針對SS抗體，中和體內(nèi)SS，解除SS的抑制作用，促進動物的生長。本研究通過PCR的方法擴增得到PCV20 RF2基因和在其末端引入SS基因的ORF2-SS基因片段，將其克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)pFastBacTM HT B載體中，經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定篩選獲得的陽性重組質(zhì)粒pF-Cap和pF-Cap-SS，轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭載體的DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌中，

12、經(jīng)藍白菌落篩選和PCR鑒定，獲得重組表達載體rBac-Cap和rBac-Cap-SS。在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒rAt-Cap和rAc-Cap-SS，將重組病毒傳代擴增。間接免疫熒光和Western-blot實驗結(jié)果表明，目的蛋白BCap和BCap-SS得到正確表達，表達的蛋白具有良好的反應原性；將目的蛋白超離純化，電鏡觀察可以形成病毒樣顆粒(VLPs)．將病毒傳代增殖，空斑試驗檢測重組病毒滴度可達5

13、×107pfu/mL.
　　 5．桿狀病毒系統(tǒng)表達的PCV2 Cap-生長抑素融合重組蛋白亞單位疫苗免疫特性研究將桿狀病毒表達獲得的重組Cap-SS蛋白(BCap-SS)制備疫苗，評價其免疫效果和對動物體增重的影響。小鼠試驗結(jié)果為：BCap-SS和BCap兩種重組蛋白均可誘導產(chǎn)生PCV2特異抗體，兩次免疫后ELISA抗體效價可達1:1600，BCap-SS免疫組小鼠增重高于BCap和空白組。豬體試驗結(jié)果為：兩次免疫后可誘導豬體產(chǎn)

14、生較高水平的PCV2特異ELISA抗體(1:1024)；首免后2周和4周，BCap-SS免疫組豬相對日增重(RDWG)明顯高于其余各組，2周時血清SS濃度明顯降低，顯示出較好的促增重效果。免疫豬攻毒后，BCap-SS與其它疫苗免疫組僅出現(xiàn)短時間的發(fā)熱，每組只有1-2頭豬表現(xiàn)出精神稍差，而攻毒對照組所有豬發(fā)熱時間較長，精神沉郁。攻毒后的25天內(nèi)攻毒對照組RDWG明顯低于其他各組。此外，疫苗免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學變化方面相

15、似，明顯輕于攻毒對照組。這表明桿狀病毒表達的BCap-SS有望成為即可預防PCVD又可改善生產(chǎn)性能的新型疫苗。
　　 6．大腸桿菌系統(tǒng)表達PCV2 Cap-生長抑素融合蛋白重組體構(gòu)建與免疫特性研究將生長抑素SS基因引入Cap-C編碼基因的末端，克隆入原核表達載體pET-32a(+)，在大腸桿菌中表達，SDS-PAGE結(jié)果表明重組蛋白獲得表達，經(jīng)包涵體洗滌純化復性后可得到較高純度的重組蛋白，將純化的重組蛋白Cap-SS制備疫苗，以

16、Cap-C作為對照進行豬體攻毒保護試驗，評價其免疫效果和對動物體增重的影響，結(jié)果為：兩次免疫后可誘導豬體產(chǎn)生較高水平的特異抗體，首免后4周時，Cap-SS免疫組豬相對日增重（RDWG）明顯高于其余各組，血清SS水平在2周時顯著低于其余各組，顯示器其具有較好促增重效果。攻毒后，免疫組僅出現(xiàn)短時間的發(fā)熱，沒有明顯臨床癥狀。攻毒后的25天內(nèi)攻毒對照組RDWG明顯低于其他各組。此外，免疫組在病毒血癥、淋巴結(jié)病毒載量、病理學變化方面相似，明顯輕于

17、攻毒對照組，證明大腸桿菌系統(tǒng)表達PCV2 Cap-生長抑素融合蛋白亞單位疫苗具有較好免疫保護作用和促生長作用。
　　 綜上所述，本研究證實了我國東部2001-2009年P(guān)CV2流行毒株有PCV2a和PCV2b兩個基因型，主要為PCV2b，豐富了我國PCV2分子流行病學資料。同時證實大腸桿菌表達的Cap蛋白第51-234aa片段具有很好的反應原性和免疫原性，并可誘導仔豬產(chǎn)生免疫保護反應。桿狀病毒和大腸桿菌表達的Cap-SS融合蛋白