先天性甲減伴甲狀腺腫大患兒DUOX1突變篩查及DUOX1-DUOXA1突變致病機(jī)理研究.pdf

1、目的：研究中國山東地區(qū)先天性甲狀腺功能減退癥（Congenital hypothyroidism, CH）伴甲狀腺腫大患兒雙氧化酶1（DUOX1）基因突變的類型及特點(diǎn)，并對(duì)突變CH患兒的臨床表型進(jìn)行確認(rèn)，建立基因型與表型的關(guān)系。對(duì)本次研究發(fā)現(xiàn)的DUOX1基因突變及前期工作中發(fā)現(xiàn)的雙氧化酶成熟因子1（DUOXA1）基因突變進(jìn)行功能學(xué)研究，從而闡明DUOX1/DUOXA1基因突變導(dǎo)致CH的致病機(jī)理。
　　方法：選取43例甲狀腺腫大的C

2、H患兒及100例正常對(duì)照新生兒作為研究對(duì)象，提取其外周血基因組DNA，采用PCR及一代測序的方法，對(duì)DUOX1基因全部外顯子進(jìn)行突變篩查。對(duì)本次研究發(fā)現(xiàn)的DUOX1基因突變（c.3910G>A, p.R1307Q）及前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1基因突變（c.166C>T, p.R56W）進(jìn)行功能學(xué)研究。首先，構(gòu)建DUOX1、DUOXA1野生型及突變型真核表達(dá)載體，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。利用q-PCR及Western-blot技術(shù)從

3、mRNA及蛋白水平上檢測DUOX1/DUOXA1基因突變對(duì)DUOX1基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響。其次，利用多功能酶標(biāo)儀檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48h后過氧化氫（H2O2）的生成量，判斷DUOX1/DUOXA1基因突變對(duì)DUOX1酶活性的影響。最后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后加入放線菌酮（Cycloheximide, CHX），CHX加入后的24h內(nèi)選取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測細(xì)胞內(nèi)DUOX1蛋白的含量，計(jì)算DUOX1蛋白的降解速率

4、來判斷DUOX1基因突變對(duì)其蛋白穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果：在43例伴甲狀腺腫大的CH患兒中，發(fā)現(xiàn)1例患兒帶有DUOX1雜合錯(cuò)義突變（c.3910G>A, p.R1307Q），且攜帶該突變的患兒表現(xiàn)為輕度的暫時(shí)性甲低。前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1雜合錯(cuò)義突變（c.166C>T, p.R56W），攜帶該突變的患兒表現(xiàn)為永久性甲低。功能學(xué)研究表明，DUOX1基因突變并未改變DUOX1蛋白的穩(wěn)定性，但DUOX1/DUOXA1基因突變均導(dǎo)致

5、DUOX1蛋白表達(dá)量減少，DUOX1酶活性下降。此外，與同時(shí)轉(zhuǎn)染野生型DUOX1/DUOXA1質(zhì)粒的Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染突變型DUOXA1質(zhì)粒或同時(shí)轉(zhuǎn)染突變型DUOX1/DUOXA1質(zhì)粒的Hela細(xì)胞，產(chǎn)生H2O2的能力顯著下降，證實(shí)DUOXA1在DUOX1催化合成H2O2的過程中起到輔助作用。
　　結(jié)論：43例甲狀腺腫大的CH患兒中有1例患兒帶有DUOX1基因雜合錯(cuò)義突變（c.3910G>A, p.R1307Q），但DUOX1

6、基因突變率低，可能不是中國山東地區(qū)CH伴甲狀腺腫大患兒發(fā)病的主要因素。對(duì)該突變及前期工作中發(fā)現(xiàn)的DUOXA1基因雜合錯(cuò)義突變進(jìn)行功能學(xué)研究，研究表明DUOX1/DUOXA1基因突變均造成H2O2生成能力部分喪失，甲狀腺激素合成不足，促甲狀腺激素反饋性增加，刺激甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，臨床上表現(xiàn)為先天性甲減伴甲狀腺腫大，且DUOXA1在DUOX1催化合成H2O2的過程中起到輔助作用。此外，攜帶DUOX1基因雜合錯(cuò)義突變的CH患兒臨床表現(xiàn)為暫時(shí)