AK3基因在細胞中的過表達分析.pdf

1、第一部分、AK3基因在細胞中的過表達分析
　　目的：為了研究AK3蛋白的生物學功能,構建重組質粒pcDNA3.1-AK3-FLAG并將其轉染到細胞中,通過間接免疫熒光法、免疫共沉淀反應來觀察在哺乳動物細胞內AK3蛋白和Sedlin蛋白的表達以及定位情況,驗證二者之間是否存在相互作用,并利用GST pulldown實驗研究AK3蛋白和Sedlin蛋白在體外是否存在相互作用。
　　方法：設計AK3的上下游引物,以AK3的全長cD

2、NA序列為模板,PCR擴增出AK3序列,將其構建到pcDNA3.1真核表達載體中,將酶切鑒定正確的pcDNA3.1-AK3-FLAG重組質粒送到上海生工公司測序,經BLAST比對,將測序正確的質粒轉染到COS7細胞,觀察AK3在COS7細胞內的空間分布,再與Sedlin共同轉染到COS7細胞,觀察AK3與Sedlin蛋白在細胞內的共定位情況,單獨轉染pcDNA3.1-AK3-FLAG到HEK293T細胞,再與pCDGFP-Sedlin共

3、同轉染到293T細胞,用免疫共沉淀驗證兩者是否存在相互作用。GST-Sedlin轉化到BL21感受態(tài)細胞中,成功制備融合蛋白,同時轉染 pcDNA3.1-AK3-FLAG到293T細胞通過GST pulldown技術檢測兩者在體外相互作用情況。
　　結果：酶切鑒定與公司測序的結果表明重組質粒pcDNA3.1-AK3-FLAG構建成功。熒光顯微鏡檢測AK3在細胞質中呈現(xiàn)點狀分布,在細胞核中無明顯分布。而Sedlin在細胞核及細胞質中

4、均有分布,二者在COS7細胞中不存在共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀實驗證明帶FLAG標簽的AK3蛋白并不能夠把帶GFP標簽的Sedlin蛋白沉淀下來,而在適當濃度IPTG誘導下,GST-Sedlin融合蛋白表達成功,GST pulldown實驗驗證了體外條件下AK3蛋白并沒有和Sedlin蛋白相互作用。
　　結論：通過免疫熒光實驗,結果說明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在細胞中不存在共定位現(xiàn)象,而免疫共沉淀和GST pulldown實驗證

5、明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在體外和細胞內都不存在相互作用。
　　第二部分、Sedlin點突變體與EBI3相互作用的初步研究
　　目的：為了研究Sedlin點突變體與EBI3之間的相互作用,構建pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,并將pCDGFP-SEDL-D47Y,和pCDGFP-SEDL-S73L轉染到COS7細胞中觀察其在哺乳動物細胞中的定位情況并和野生型的進行比較。再將帶GFP標簽

6、的Sedlin點突變體分別與帶FLAG標簽的EBI3蛋白共同轉染至COS7細胞中觀察共定位的情況。將其共定位的情況與野生型的Sedlin與EBI3蛋白的共轉情況做比較。
　　方法：對Sedlin點突變體蛋白全長的編碼序列進行PCR擴增。目的片段酶切回收后插入到帶GFP標簽的載體中,構建表達載體pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,將這兩個質粒分別染至COS7細胞,在熒光顯微鏡下分別觀察pCDGFP-S

7、EDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L在哺乳動物細胞的定位情況,并比較與野生型的差別。再將pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L分別與FLAG-EBI3共同轉染至COS7細胞,熒光顯微鏡下觀察比較兩組蛋白在細胞內與FLAG-EBI3的共定位情況。
　　結果：pCDGFP-SEDL-D47Y、pCDGFP-SEDL-S73L真核表達載體經酶切和測序鑒定,各重組質粒均構建正確。免疫熒光顯微鏡觀察

8、Sedlin蛋白的兩個點突變體和Flag-EBI3蛋白共同轉染至COS7細胞中后的情況,觀察結果表明GFP-SEDL-D47Y與FLAG-EBI3的共定位情況與野生型相似,在核內核周都有分布,而SEDL-S73L與EBI3主要共定位于核周。
　　結論：Sedlin蛋白點突體與EBI3的免疫熒光共定位表明,SEDL-D47Y和EBI3在細胞內存在共定位,且定位情況和野生型相似。而SEDL-S73L和EBI3的共定位主要分布在核周附近