RSV感染氣道黏液高分泌的調(diào)控機(jī)制及羅格列酮的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　1.觀察呼吸道合胞病毒(RSV)感染后，人支氣管上皮(HBE)細(xì)胞12h、24h、48h過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和叉頭框蛋白A2（FOXA2）mRNA、表皮生長因子（EGFR）mRNA表達(dá)和p-EGFR、EGFR蛋白比值、黏蛋白(MUC5AC)蛋白水平的變化。探討 RSV感染后，氣道黏液高分泌的調(diào)控作用。
　　2.觀察PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮和PPAR-γ拮抗劑(GW9662)及EGFR抑制

2、劑（AG1478）干預(yù)后RSV感染HBE細(xì)胞PPAR-γ和FOXA2 mRNA表達(dá)、EGFR mRNA表達(dá)、p-EGFR/EGFR蛋白比值及MUC5AC蛋白水平的變化，探討羅格列酮干預(yù)對(duì)RSV感染氣道黏液高分泌的抑制作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.將HBE細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80％-90%左右時(shí)，于96孔板中配制100μL的HBE細(xì)胞懸液,培養(yǎng)板預(yù)培養(yǎng)24h(在37℃，5%CO2),向培養(yǎng)板加入10μL的10-50

3、μmol/L的羅格列酮、GW9662及AG1478及0.1%DMSO。將培養(yǎng)板分別孵育12h、24h及48h,向每孔加入10μL CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度。
　　2.建立RSV感染的體外HBE細(xì)胞模型，將HBE細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%-90%左右時(shí)，按每孔2*105傳代于六孔板中，隨機(jī)分成6組：A組（AG1478+RSV組）、B組（羅格列酮+RSV組）、C組（GW9662+RS

4、V組）、D組（RSV組）、E組（0.1%DMSO+細(xì)胞組）、F組（細(xì)胞對(duì)照組）。RSV感染HBE細(xì)胞造模前2h，A組予AG1478（10μmol/L）預(yù)處理，B組予羅格列酮（10μmol/L）預(yù)處理，C組予GW9662（10μmol/L）預(yù)處理。A-D組以100TCID50 RSV感染吸附HBE細(xì)胞2h后加維持液繼續(xù)培養(yǎng)，各組分別培養(yǎng)至12h、24h、48h，收獲細(xì)胞及上清液進(jìn)行檢測。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測上述3個(gè)

5、不同時(shí)間點(diǎn)各組EGFR、PPAR-γ、FOXA2 mRNA表達(dá)情況，Western Blot方法檢測p-EGFR及EGFR蛋白水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.病毒滴度測定：
　　本實(shí)驗(yàn)RSV的TCID50為10-4.4/50μl，病毒攻擊量為100TCID50。即10-2.4/50μl。
　　2.羅格列酮、GW9662、AG1478及0.1%DMSO的細(xì)

6、胞毒性：
　　10μmol/L羅格列酮、10μmol/L GW9662和10μmol/L AG1478及0.1%DMSO處理后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、48h）HBE細(xì)胞存活率分別99.0%、98.8%、98.0%；99.6%、98.6%、98.2%；100.2%、98.6%、98.2%,和99.6%、98.8%、98.1%與細(xì)胞對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明上述濃度的藥物對(duì)HBE細(xì)胞無毒性作用。
　　

7、3. RSV感染及羅格列酮、GW9662、AG1478干預(yù)后PPARγmRNA表達(dá)變化：
　　E、F組PPARγ僅少量表達(dá)，E組與F組相比，同一時(shí)間點(diǎn)PPARγmRNA表達(dá)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示0.1%的DMSO對(duì)PPARγmRNA表達(dá)量無影響。與F組相比，A組、B組、D組PPARγmRNA表達(dá)量均有所增加（均P＜0.05），且隨時(shí)間增加。A組、B組表達(dá)量逐漸增加，于48h達(dá)高峰，但D組表達(dá)量逐漸減少；C組表達(dá)量最少。B、

8、C、D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；三個(gè)時(shí)間點(diǎn)B組表達(dá)量均明顯高于D組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4. RSV感染及羅格列酮、GW9662、AG1478干預(yù)后EGFR mRNA表達(dá)變化：
　　E、F組EGFR mRNA表達(dá)量最少，E組與F組相比，同一時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與F組相比，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的A組、B組、C組、D組表達(dá)量均有增加（均P＜0.05），且隨時(shí)間增加，48h達(dá)到最高；三個(gè)時(shí)

9、間點(diǎn)均以D組表達(dá)量最高；與D組相比，A組、B組EGFR mRNA表達(dá)量明顯降低（均P＜0.05）。
　　5.RSV感染及羅格列酮、GW9662、AG1478干預(yù)后FOXA2 mRNA表達(dá)變化：
　　E、F組FOXA2呈高表達(dá)，E組與F組相比，同一時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與F組相比，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)A組、B組、C組、D組表達(dá)量均有降低，隨時(shí)間逐漸升高，其中D組表達(dá)量最低（均P＜0.05）。與D組相比，A組、B組的表達(dá)量明

10、顯升高（均P＜0.05）。
　　6.RSV感染及AG1478、羅格列酮、GW9662干預(yù)后MUC5AC蛋白的表達(dá)變化：
　　E、F組表達(dá)量最少，E組與F組相比，同一時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與F組相比，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)A組、B組、C組、D組表達(dá)量均明顯增加（均P＜0.05），且隨時(shí)間增加而增加，在48h達(dá)高峰，其中D組表達(dá)量最高；與D組相比，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上A組、B組表達(dá)量均有降低（除12h的A組P＞0.05外，均P＜0.0

11、5）；相較于A組，B組表達(dá)量降低更明顯（P＜0.05）。
　　7. RSV感染及AG1478、羅格列酮、GW9662干預(yù)后p-EGFR/EGFR蛋白比值變化：
　　E、F組比值最低，E組與F組相比，同一時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與F組相比，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的A組、B組、C組、D組比值均明顯增加（均P＜0.05），且隨時(shí)間增加而增加，在48h達(dá)到最高，其中D組比值最高；與D組相比，A組、B組蛋白量比值均明顯降低（均P＜0.05）。

12、r>　　結(jié)論：
　　1. RSV感染后MUC5AC蛋白表達(dá)增加，表明RSV感染可引起氣道黏液高分泌；同時(shí)PPAR-γ及EGFR表達(dá)增加、FOXA2表達(dá)減少，表明PPAR-γ、EGFR-FOXA2信號(hào)通路參與RSV感染后氣道黏液高分泌過程。
　　2. EGFR抑制劑干預(yù)后，可明顯降低RSV感染后p-EGFR/ EGFR的蛋白比值及MUC5AC蛋白水平，F(xiàn)OXA2 mRNA的表達(dá)增加。證實(shí)EGFR通過抑制FOXA2的表達(dá)，參與R