氣道冷敏受體在冷刺激誘導氣道黏液高分泌中的作用.pdf

1、目的：明確人氣道粘膜上皮組織中是否有瞬時受體電位蛋白-8(TRPM8)的表達及其分布特點，并進一步探討其在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者與正常人氣道粘膜上皮組織中的表達差異；探明人氣道上皮細胞TRPM8受體的基本特性；明確冷刺激是否誘導黏液高分泌及TRPM8受體在此過程中所起的作用；初步探明冷刺激誘導黏液高分泌過程的相關信號轉導機制。本實驗籍TRPM8為切入點研究冷刺激作用于氣道所產(chǎn)生的對黏液分泌的調控作用及信號轉導機制，以期探明冷刺

2、激在慢性氣道炎癥性疾病中的作用，為預防及控制冷空氣刺激誘發(fā)此類疾病的反復發(fā)作提供新的思路。
　　方法：(1)收集行肺葉切除術患者的上葉段支氣管開口處粘膜組織，采用免疫組織化學檢測TRPM8蛋白的表達及其分布特點，用Imagepro-plus6.0軟件進行圖像分析以比較COPD患者與正常人氣道粘膜上皮組織中的表達差異，并進一步采用Western bolt法及實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)法分別檢測COPD患者

3、與正常人氣道粘膜上皮組織中TRPM8蛋白及TRPM8 mRNA的表達差異。(2)體外培養(yǎng)16HBE細胞，MTT法檢測不同濃度左旋薄荷醇(menthol)、TRPM8通道特異性拈抗劑BCTC及冷刺激對細胞活力的影響。用Fluo3-AM進行熒光探針裝載，激光共聚焦測量細胞內鈣離子濃度。16HBE細胞經(jīng)不同濃度menthol處理后檢測細胞內鈣離子濃度，以選取最佳作用濃度。為探明TRPM8陽離子通道的基本特點，用TRPM8shRNA、scram

4、ble TRPM8 shRNA穩(wěn)定轉染16HBE細胞，并采用Western bolt法檢測TRPM8 shRNA轉染組、scrmnble TRPM8 shRNA轉染組、轉染前對照組的TRPM8蛋白表達水平，以明確TRPM8 shRNA對TRPM8基因的沉默效率。分別設立1mM menthol組、1mM menthol+BCTC組、1mM menthol+TRPM8 shRNA組、1mM menthol+scramble TRPM8 sh

5、RNA組；18℃組、18℃+BCTC組、18℃+TRPM8shRNA組、18℃+scramble TRPM8 shRNA組，采用鈣調子成像技術檢測細胞內鈣離子動態(tài)變化。(3)將培養(yǎng)的16HBE細胞分為：1mMmenthol組、1mM menthol+BCTC15μm組、1mM menthol+TRPM8shRNA組、1mM menthol+scramble TRPM8 shRNA組，18℃組、18℃+BCTC15μm組、18℃+TRPM

6、8 shRNA組、18℃+scrambleTRPM8 shRNA組，收集各個時點的培養(yǎng)上清液及細胞，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測定各組培養(yǎng)上清液及細胞內MUC5AC蛋白含量，用real-time PCR測定各組細胞MUC5AC mRNA含量。進一步將細胞分為①1mM menthol組、1mM menthol+BCTC15μm組、1mMmenthol+TRPM8 shRNA組(各組均處理26h)；②18℃組、18℃+BCTC15μm

7、組、18℃+TRPM8 shRNA組(各組均處理6h)，采用免疫細胞化學染色，激光共聚焦顯微鏡觀察氣道各組細胞MUC5AC的免疫熒光表達情況。(4)pEGFP-N1 vector、PLCδ1-PH-GFP轉染6HBE細胞，并分組處理：對照組(pEGFP-N1 vector轉染+1mM menthol組、pEGFP-N1 vector轉染+18℃)、實驗組(PLCδ1-PH-GFP轉染+1mM menthol組、PLCδ1-PH-GFP轉

8、染+1mM menthol+BCTC15μM組、PLCδ1-PH-GFP轉染+1mM menthol+TRPM8 shRNA組、PLCδ1-PH-GFP轉染+18℃組、PLCδ1-PH-GFP轉染+18℃+BCTC15μM組、PLCδ1-PH-GFP轉染+18℃+TRPM8 shRNA組。激光共聚焦掃描顯微鏡下動態(tài)觀察各組GFP綠色熒光在細胞膜和細胞漿區(qū)域的分布，計算各時點細胞平均膜(Fm)/漿熒光強度(Fc)比率。(5)用人胎盤組織c

9、DNA為模板，利用PCR技術構建MARCKS目的基因載體，再利用重疊PCR技術將PSD位點的4個絲氨酸用天冬氨酸替換，并構建突變型基因載體。重組質粒經(jīng)酶切及測序鑒定后將空載體、MARCKS-PSD-mutant質粒、野生型MARCKS質粒穩(wěn)定轉染16HBE細胞，分別用1mM menthol刺激28h及冷刺激8h處理細胞，測定每組細胞分泌MUC5AC蛋白水平。
　　結果：(1)免疫組化顯示TRPM8陽性染色細胞位于支氣管粘膜上皮內，

10、TRPM8蛋白主要分布于支氣管粘膜上皮基底細胞或小顆粒細胞的細胞膜，部份分布于柱狀上皮細胞或杯狀細胞的胞漿(尤其是靠近管腔一側)及細胞膜。用Imagepro-plus6.0軟件進行圖像分析，以黃色區(qū)域作為AOI(area of interest)，結果發(fā)現(xiàn)：COPD組的支氣管粘膜上皮IOD/area值(0.24±0.049)顯著高于正常對照組(0.19±0.036)，P=0.037，差異有統(tǒng)計學意義。real-time PCR結果顯示：

11、COPD組支氣管粘膜內TRPM8 mRNA相對表達量為對照組的3.13±0.39倍，顯著高于正常對照組(P=0.012)，差異有統(tǒng)計學意義。Western-blot結果顯示：COPD組支氣管粘膜內TRPM8蛋白相對表達量顯著高于正常對照組(P=0.030)，差異有統(tǒng)計學意義。(2)細胞經(jīng)不同濃度menthol、BCTC及18℃處理后，細胞的增殖活力在各時間點與對照組比較無明顯變化，而30μm及60μm BCTC對細胞的活力有抑制作用。1

12、mM menthol處理組細胞內鈣離子濃度顯著高于低濃度menthol處理組，而更高濃度menthol的作用并不優(yōu)于1mM menthol，所以在后續(xù)的實驗中選擇1mM menthol作為刺激濃度。穩(wěn)轉染TRPM8 shRNA、scramble TRPM8shRNA的16HBE細胞生長速度及形態(tài)與正常細胞無差異。TRPM8shRNA轉染組TRPM8蛋白表達量顯著低于轉染前對照組及scrambleTRPM8 shRNA轉染組，而scram

13、ble TRPM8 shRNA轉染組與對照組比較TRPM8蛋白表達則無明顯差異。1mM menthol在處理細胞0.5min-8min的各個時相點細胞內的鈣離子濃度均顯著高于vehicle control組，其中從0.5min到4min時間段細胞內的鈣離子濃度呈明顯上升趨勢，4min后出現(xiàn)平臺期。5，10，15μm BCTC對1mM menthol所誘導的鈣離子內流起到抑制作用，轉染了TRPM8 shRNA的細胞其鈣離子內流同樣受到抑制

14、。1mM menthol處理細胞4min時，15μm BCTC的抑制作用明顯強于5，10μm BCTC(P<0.05)，TRPM8 shRNA的轉染可顯著阻斷1mM menthol所誘導的細胞內鈣離子濃度升高(P<0.05)，而scramble TRPM8 shRNA則對1mM menthol所誘導的細胞內鈣離子濃度沒有顯著影響(P>0.05)。18℃在處理細胞0.5min-8 min的各個時相點細胞內的鈣離子濃度均顯著高于未處理對照組

15、，其中從0.5min到6min時間段細胞內的鈣離子濃度呈明顯漸進上升趨勢，6min后出現(xiàn)平臺期。5，10，15μm BCTC對冷刺激所誘導的鈣離子內流起到抑制作用，轉染了TRPM8 shRNA的細胞其鈣離子內流同樣受到抑制。冷刺激處理細胞6min時，15μm BCTC的抑制作用明顯強于5，10μmBCTC(P<0.05)。TRPM8 shRNA的轉染可顯著阻斷冷刺激所誘導的細胞內鈣離子濃度升高(P<0.05)，而scramble TRP

16、M8 shRNA則對冷刺激所誘導的細胞內鈣離子濃度沒有顯著影響(P>0.05)。鑒于15μmBCTC對1mM menthol及冷刺激所誘導的細胞內鈣離子濃度升高的抑制作用顯著強于5，10μm BCTC，所以在后續(xù)的實驗中選擇15μm作為最終的實驗濃度。(3)細胞受1mM menthol或冷刺激處理后其MUC5AC mRNA表達分別于5h及1h后開始明顯升高，峰值分別出現(xiàn)在24h及4h，分別較vehicle對照組及未處理對照組升高3.08

17、及2.57倍(P=0.00)，繼峰值后MUC5AC mRNA的表達有下降趨勢。BCTC及TRPM8 shRNA在峰值出現(xiàn)時點可顯著抑制MUC5AC mRNA表達，而scramble TRPM8 shRNA對MUC5AC mRNA表達無明顯影響。由細胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白在1mM menthol刺激后于5min時迅速升高，緊接著進行平臺期(5 min-360 mm)，繼平臺期后MUC5AC蛋白的分泌呈漸近持續(xù)升高，直到28h后再度

18、進入平臺期。MUC5AC蛋白的分泌于28h時為vehicle對照組的3.19倍(P=0.00)。冷刺激組于10min時胞外的MUC5AC蛋白表達迅速升高，平臺期為10min-120min，繼平臺期后MUC5AC蛋白的分泌呈漸近持續(xù)升高，直到8h后再度進入平臺期。MUC5AC蛋白的分泌值于8h時為未刺激對照組的2.18倍(P=0.00)。BCTC及TRPM8 shRNA于28h時點可顯著抑制1mM menthol誘導的MUC5AC蛋白的分

19、泌(P值均為0.00)，而scramble TRPM8 shRNA對1mM menthol誘導的MUC5AC蛋白分泌無明顯影響(P=0.154)；BCTC及TRPM8 shRNA在8h時點可顯著抑制冷刺激誘導的MUC5AC蛋白分泌(P值均為0.00)，而scrambleTRPM8 shRNA對冷刺激誘導的MUC5AC蛋白分泌無明顯影響(P=0.373)。胞內合成的MUC5AC蛋白在1mM menthol刺激組于8h后明顯升高，并于26h

20、達到峰值，為vehicle對照組的1.50倍(P=0.00)，繼峰值后出現(xiàn)明顯的下降趨勢。胞內合成的MUC5AC蛋白在冷刺激組于4h后明顯升高，并于6h達到峰值，為未刺激對照組的1.45倍(P=0.00)，繼峰值后出現(xiàn)明顯的下降趨勢。BCTC及TRPM8 shRNA在峰值出現(xiàn)時點可顯著抑制1mM menthol及冷刺激誘導的胞內MUC5AC蛋白表達，而scrmnble TRPM8 shRNA對胞內MUC5AC蛋白表達無明顯影響。免疫細胞

21、化學結果顯示：1mM menthol或冷刺激分別作用于細胞26h、6h后，細胞胞漿中MUC5AC表達較對照組有明顯增加，BCTC及TRPM8 shRNA對1mM menthol或冷刺激誘導的胞內MUC5AC蛋白表達起顯著抑制作用，scramble TRPM8 shRNA對1mMmenthol或冷刺激誘導的胞內MUC5AC蛋白表達無明顯影響。(4)16HBE細胞表達PLCδ1-PH-GFP作為PLCδ1-PH-GFP組，表達pEGFP-N

22、1 vector的細胞作為對照組。結果顯示，對照組細胞給予menthol或冷刺激處理前后，GFP的綠色熒光未見轉位變化，均持續(xù)呈胞漿與胞膜非特異性分布。在PLCδ1-PH-GFP組，menthol或冷刺激處理前，可見綠色熒光在胞膜上濃集，而在胞漿呈低亮度及不均勻分布；給予menthol或冷刺激處理后，胞膜的綠色熒光漸降低同時胞漿熒光漸變亮，其動力學特征為：在給予menthol處理60 s后即出現(xiàn)明顯的綠色熒光轉位，在60-200 s期間

23、呈持續(xù)綠色熒光轉位，并于給藥200 s后出現(xiàn)轉位的停滯狀態(tài)；在給予冷刺激處理60 s后即出現(xiàn)明顯的綠色熒光轉位，在60-220 s期間呈持續(xù)綠色熒光轉位，繼之進入轉位的停滯狀態(tài)。BCTC及TRPM8 shRNA對menthol及冷刺激誘導的綠色熒光轉位有顯著抑制作用。(5)本實驗成功構建了PSD-mutant MARCKS突變體。轉染PSD-mutant MARCKS cDNA可顯著抑制由menthol及冷刺激誘導的MUC5AC蛋白分泌

24、(P值均為0.002)，而轉染野生型MARCKS組的MUC5AC蛋白分泌與menthol及冷刺激組比較沒有顯著差異(P=0.943，P=0.421)，載體對照組的MUC5AC蛋白分泌與menthol及冷刺激組比較亦沒有顯著差異(P=0.486，P=0.139)。
　　結論：(1)人氣道粘膜上皮組織表達TRPM8蛋白。COPD患者氣道粘膜上皮組織中，TRPM8 mRNA及蛋白的表達水平明顯高于正常人。因TRPM8是一個特異性的冷敏感

25、受體，可以被低溫激活，故COPD患者氣道粘膜上皮TRPM8蛋白的過表達狀態(tài)可能是其對外界冷空氣相對較敏感的重要原因之一。(2)menthol及冷刺激均呈時間依賴性地誘導細胞內鈣離子濃度的顯著升高，BCTC及TRPM8 shRNA的轉染可阻斷鈣離子內流，而SCFalnble TRPM8 shRNA則對細胞內鈣離子濃度沒有顯著影響。以上結果證明16HBE細胞上表達的TRPM8離子通道具有被冷刺激激活的基本特點，16HBE細胞通過TRPM8離

26、子通道感知外界冷刺激。Menthol及冷刺激誘導胞內鈣離子濃度迅速升高，緊接著出現(xiàn)一個平臺期，平臺期的出現(xiàn)預示著冷刺激激活的TRPM8受體存在脫敏現(xiàn)象。(3)長時間的menthol或冷刺激不僅可以誘導黏蛋白的瞬時高分泌狀態(tài)，menthol或冷刺激還可上調黏蛋白基因的表達并導致后續(xù)的黏蛋白合成及分泌相應升高。MUC5AC基因表達的上調、胞內MUC5AC蛋白合成及后續(xù)的MUC5AC蛋白分泌均可能與由冷刺激或menthol誘導產(chǎn)生的細胞因子及