斑馬魚p8、p8-L1和p8-L2基因的時空表達及其在脅迫反應中的作用研究.pdf

1、轉錄因子在動物的生長發(fā)育及其對外界脅迫的反應中起著重要的作用。螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子是動物轉錄因子最大的家族之一。p8,又稱com1或Nupr1,是在結構上具有bHLH基序的轉錄因子。近年來,該基因在哺乳動物應急反應中的作用引起了很大的關注,但其在魚類脅迫反應中作用還知之甚少。魚類的生活環(huán)境變化較大,在脅迫條件下,易引起自身免疫力的低下,進而導致疾病的爆發(fā)。本論文擬以模式魚類生物-斑馬魚為研究對象,對p8及同樣屬于p8超家族

2、的p8-L1(p8-like1)和p8-L2(p8-like2)基因進行克隆,闡明這些基因的組織分布及在胚胎發(fā)育中的表達規(guī)律；在此基礎上研究這些基因對各種脅迫因子的響應,并進一步嘗試研究它們參與脅迫反應的調控機制,勢必會對魚類的健康養(yǎng)殖具有重要的理論指導意義。
　　 斑馬魚p8 cDNA全長730 bp,位于3號染色體,最大開放閱讀框編碼一個含有75個氨基酸的蛋白質,理論分子量約8.961KDa,等電點為8.433。斑馬魚p8蛋

3、白在39-65和60-74氨基酸殘基處分別有bHLH和NLS的保守序列。斑馬魚p8基因組含有3個外顯子和2個內含子,3個外顯子大小分別是225bp、138bp和353bp。系統(tǒng)進化樹分析顯示,斑馬魚p8與脊椎動物的p8親緣關系較近。p8-L1和p8-L2 cDNA全長分別是742bp和813bp,均位于5號染色體,具有相同的ORF,編碼一個含有76個氨基酸的蛋白質,理論分子量均約為8.801KDa,等電點均為8.86。但二者的基因組結構

4、不同,斑馬魚p8-L1基因組含有3個外顯子和2個內含子,3個外顯子大小分別是291bp、208bp和147bp,而p8-L2基因組只含有1個外顯子,大小是813bp。和p8一樣,二者均具有Phospho_p8 domain。
　　 Quantitive real-time PCR方法檢測三基因的時空表達規(guī)律。結果顯示,斑馬魚p8mRNA在被檢測的各組織和不同的發(fā)育時期均廣泛表達。其中在脊柱中表達最高,在肝臟、腦組織中表達較強,在

5、鰓、腸、肌肉中表達較弱；斑馬魚p8的mRNA在胚胎發(fā)育的各時期差異很大,在卵裂期,母源性的轉錄物較高存在,隨后表達量持續(xù)降低,到體節(jié)期最低,而在孵化期的表達又急劇升高。這些結果表明,斑馬魚p8是作為一種管家基因在各組織中廣泛表達,且可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。斑馬魚p8-L1的組織表達與p8差異較大,而斑馬魚p8-L2與p8較為相近；三者在胚胎各時期的表達模式基本相同,但在孵化期后兩者表達升高不明顯。另外,胚胎整體原位雜交與Quant

6、itive real-time PCR分析結果基本一致,研究顯示,斑馬魚p8基因廣泛表達于整個卵裂球中,一直持續(xù)到原腸胚期；到了體節(jié)形成期,在頭部區(qū)域和脊索腹面?zhèn)葏^(qū)域表達較強,背面?zhèn)葏^(qū)域幾乎不表達,隨著體節(jié)的形成逐漸完全,整體表達較弱,頭部區(qū)域表達較強,軀干及尾部區(qū)域信號較弱；到了孵化期,整體表達更弱。斑馬魚p8-L1和p8-L2的表達也均與p8相類似。這些結果提示,斑馬魚p8、p8-L1和p8-L2在中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育及眼、心臟、血管

7、和內臟等各組織、器官的早期分化中均發(fā)揮重要作用。
　　 用多種環(huán)境脅迫因子(饑餓、溫度、滲透壓、pH值)處理成體斑馬魚,Quantitive real-time PCR方法檢測斑馬魚p8、p8-L1及p8-L2基因的對不同環(huán)境脅迫的響應。結果顯示,斑馬魚p8在受到饑餓、溫度、滲透壓、pH值等不同環(huán)境因子脅迫后,其表達都明顯上調,證明斑馬魚p8是一個應激相關分子,參與了廣泛的脅迫反應。斑馬魚p8-L1及p8-L2基因受到脅迫后(滲