ZBTB蛋白家庭成員—ZBTB8A的生物學(xué)功能初探.pdf

1、ZBTB蛋白是C2H2型鋅指蛋白家族的重要成員,作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,廣泛的參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生命活動。本實驗室通過RT-PCR從胃癌細(xì)胞AGS中克隆到一個ZBTB家族基因ZBTB8A(Zinc finger and BTB domain containing8A)。目前未見關(guān)于ZBTB8A的文獻(xiàn)報道,故本文對該基因展開了初步的探索。
　　 生物信息學(xué)分析表明,ZBTB8A(NM00104

2、0441)位于第1號染色體,定位在1p35.1。該基因含有1326bp開放閱讀框,編碼一個由441個氨基酸組成,分子量為50KD的蛋白。SMART分析表明ZBTB8A蛋白N端含有一個BTB結(jié)構(gòu)域,C端含有兩個典型的C2H2型鋅指基序。同源性分析顯示該蛋白BTB結(jié)構(gòu)域和多個ZBTB家族成員的BTB結(jié)構(gòu)域是高度同源的。
　　 通過構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-ZBTB8A進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示ZBTBSA定位于細(xì)胞核

3、且呈斑點狀分布。為鑒定ZBTB8A蛋白的不同結(jié)構(gòu)域?qū)Χㄎ坏挠绊?構(gòu)建了一系列截短型ZBTB8A與綠色熒光蛋白融合表達(dá)的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果顯示鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)BTB8A蛋白的細(xì)胞核定位起關(guān)鍵作用,而BTB結(jié)構(gòu)域?qū)τ赯BTB8A在細(xì)胞核內(nèi)的斑點狀定位是必需的。
　　 大量研究表明ZBTB蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此,本文首先應(yīng)用pGa145tkLuc報告載體分析ZBTB8A的轉(zhuǎn)錄激

4、活／抑制作用,數(shù)據(jù)表明ZBTB8A是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子。其次利用一系列信號通路報告載體,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析ZBTB8A對AP1,NFAT,MYC,Rb,HSE,CRE,AP1(PMA),GRE和NF-κB相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。結(jié)果表明ZBTB8A蛋白明顯抑制CRE的轉(zhuǎn)錄活性,且該抑制作用具有劑量依賴性。進(jìn)一步對ZBTB8A的不同功能區(qū)段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)表明BTB結(jié)構(gòu)域及鋅指結(jié)構(gòu)域在ZBTB8A對CRE的轉(zhuǎn)

5、錄抑制中都是非常重要的,缺失其中任一結(jié)構(gòu)域都會顯著降低該抑制作用。pCRE-Luc質(zhì)粒含有CRE元件,用來監(jiān)控CRE介導(dǎo)的信號通路,說明ZBTB8A可能在CRE介導(dǎo)的信號通路中發(fā)揮一定的抑制作用從而調(diào)控細(xì)胞的一系列功能。
　　 為進(jìn)一步開展對ZBTB8A功能的研究,我們設(shè)計并合成四個ZBTB8A干擾載體。應(yīng)用半定量PCR鑒定出有效的ZBTB8A干擾載體,并通過G418篩選獲得高表達(dá)及低表達(dá)ZBTB8A的AGS穩(wěn)定細(xì)胞株。本實驗的