CD45RA陽性細胞去除后的外周血干細胞產物體外生物學活性研究.pdf

1、目的：
　　探索異基因造血干細胞移植后不引起移植物抗宿主?。℅VHD）的安全有效的細胞過繼免疫治療方法；研究證實處女淋巴細胞（ Naive T，人類表達CD45RA+）是引起aGVHD的主要效應細胞，驗證體外利用CD45RA免疫磁珠去除供者外周血干細胞中CD45RA+細胞的可行性；檢驗去除處女淋巴細胞同時其他被去除的細胞成分；比較去除CD45RA+細胞前后的供者外周血干細胞產物其體外抗血液系統(tǒng)腫瘤、抗CMV/EBV/曲霉菌病原體以

2、及與患者自身細胞反應的活性有無差異。
　　方法：
　　CD45RA免疫磁珠分選供者外周血干細胞中的CD45RA+細胞；分選前后細胞產物分別流式細胞儀檢測CD34+及T/B/NK/CD45RA/CD45RO細胞比例；分選前后細胞產物分別做造血干細胞集落培養(yǎng)；分選前后細胞產物與不同腫瘤株共培養(yǎng)，CCK-8檢測其體外抗腫瘤活性；供受者混合淋巴細胞培養(yǎng)，CCK-8檢測其體外同種異體反應；EBV、CMV及曲霉特異性抗原刺激分選前后細胞

3、，流式檢測其IFN-γ分泌水平，同時，ELISA檢測刺激前后細胞上清液中IFN-γ水平。
　　結果：
　　1.病例資料：共10例，均為我科單倍體造血干細胞移植健康供者，經G-CSF刺激后血細胞分離機分離外周血干細胞，其中女性1例，男性9例，中位年齡33歲（18-54歲），常規(guī)檢查血清EBV/CMV，其中一例供者EBV陽性，其余供者EBV及CMV均為陰性。
　　2.利用CD45RA免疫磁珠分選供者PBSCs中的CD45R

4、A+細胞有效率達95.41％(88.21%-98.18%），目標產物中CD45RA+細胞平均2.27%（0.11%-5.06%）。因此，體外利用CD45RA免疫磁珠分選PBSCs中CD45RA+細胞是安全有效的。
　　3.分選前后細胞成分比較：分選前CD34+平均3.6%（2.45%-4.32%），CD3+細胞平均66.21%（53.5%-81.4%），CD3+CD4+平均33.7%(25.4%-43%)，CD3+CD8+平均25

5、.82%(15.8%-33.2%)，CD3-CD19+平均17.65%（7.8%-29%），CD3-CD16/56+平均11.96%（3.7%-26.9%）。分選后CD34+平均2.09%（1.78%-2.34%）， CD3+細胞平均66.31%（53.5%-81.4%），CD3+CD4+平均46.1%(16.01%-76.94%), CD3+CD8+平均14.9%(7.16%-37.62%)，CD3-CD19+平均0.29%（0%-0

6、.75%）,C D3-CD16/56+平均6.9%（0.1%-13.87%），CD45RA+平均2.27%（0.11%-5.06%），其中分選后CD34+、CD3+CD8+、CD3-CD19+細胞減少，與分選前比較具有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。
　　4.分選前后細胞產物造血干細胞集落培養(yǎng)：分選前BFU-E平均82.6個（59個-134個），CFU-GM平均39.8個（25-56個），CFU-GEMM平均16.8個（9-24個），分

7、選后BFU-E平均63.2個（35個-94個），CFU-GM平均16.2個（17-42個），CFU-GEMM平均8.2個（8-17個），其中分選后CFU-GM、CFU-GEMM集落培養(yǎng)數量較分選前明顯減少，存在統(tǒng)計學差異，P＜0.05。
　　5.分選前后細胞體外抗血液系統(tǒng)腫瘤活性：分選前后造血干細胞產物分別與K562/Jurkat/U-266/HL-604種血液腫瘤細胞株共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)分選后的細胞產物較分選前其體外抗血液腫瘤效應

8、無明顯減弱（P＞0.05），在K562效靶比40：1以及Jurkat5:1的效靶比下，P＜0.05，這種情況可能與樣本量過少有關。
　　6.分選前后細胞體外抗CMV/EBV/曲霉菌病原體活性：分選前后外周血干細胞產物經EBV/CMV/曲霉特異性抗原刺激后流式檢測CD4+/CD8+細胞IFN-γ分泌量同時ELISA檢測刺激前后細胞上清液中的IFN-γ的分泌量，我們發(fā)現(xiàn)分選后的干細胞產物體外抗病原體活性較分選前外周血干細胞并無明顯減弱

9、，部分甚至增強了對EBV/CMV/曲霉抗病原體活性。
　　7.供受者混合淋巴細胞培養(yǎng)：隨著反應細胞與刺激細胞比例的增加，反應細胞對刺激細胞的反應增加，增殖加快。同一比例下，分選前后兩組存在統(tǒng)計學差異，分選后的細胞產物體外對患者自身細胞反應較分選前減低，P＜0.05，但在效靶比1:1的情況下P＞0.05，這可能與樣本數量過少有關。
　　結論：
　　1.體外使用CD45RA磁珠能有效地清除PBSCs中的CD45RA+細胞，