短蛸Prx-4基因與Serpin基因的表達和功能研究.pdf

1、短蛸（Octopus ocellatus）在我國南北沿海均有分布,因其營養(yǎng)豐富，肉嫩鮮美，生長迅速，已成為我國北部沿海蛸類中新興的重要經(jīng)濟品種之一。由于短蛸的養(yǎng)殖成活率低、抗逆性差、苗種供應(yīng)不穩(wěn)定等因素，目前主要依靠海捕獲得。
　　隨著短蛸自然資源的不斷減少，提高養(yǎng)殖個體種質(zhì)質(zhì)量及成活率，以及改善現(xiàn)有養(yǎng)殖模式，已成為亟待解決的問題。從短蛸免疫系統(tǒng)入手，克隆和鑒定免疫相關(guān)的基因、分析其表達調(diào)控規(guī)律、并探討其在免疫防御中發(fā)揮的作用，對

2、于深入了解短蛸免疫機制、篩選抗病基因和提高短蛸抗病力具有重要意義。
　　基于前期工作構(gòu)建的短蛸cDNA文庫，本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析獲得一個短蛸過氧化物還原酶（Prx-4，命名為OoPrx-4）基因和一個Serpin型蛋白酶抑制劑（Serpin，命名為OoSerpin）基因，探討其在健康短蛸中的組織分布以及在細菌（藤黃微球菌，Micrococcus luteus或鰻弧菌，Vibrio anguillarum）刺激后血細胞中

3、的表達特征，并進一步研究短蛸絲氨酸蛋白酶抑制劑重組蛋白rOoSerpin的生物學(xué)功能。
　　過氧化物還原酶屬于抗氧化蛋白超家族，普遍存在于好氧生物中，在抗氧化脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究克隆得到了OoPrx-4基因的cDNA全長，其cDNA全長為934 bp，包括一個5’非編碼區(qū)(UTR)19 bp，一個3’ UTR177 bp，一個開放閱讀框(ORF)738 bp，共編碼245個氨基酸；OoPrx-4的理論等電點PI為6.65

4、，預(yù)測分子量為27.1 kDa；氨基酸序列1(M)-19(G)為信號肽，51(I)-201(L)是還原酶結(jié)構(gòu)域。多序列比對發(fā)現(xiàn)，OoPrx-4與長牡蠣(EKC37672)和光滑雙臍螺(ACI42880)的Prx-4相似度最高，分別為78％和73%。
　　通過熒光定量PCR檢測了Prx-4在健康短蛸不同組織中的表達分布，以及鰻弧菌刺激后在血細胞中的表達規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Prx-4在短蛸的各個檢測組織中都有表達，其中在肝胰腺的表達量最高

5、，在血細胞中表達量最低，兩者相差約70倍。受到鰻弧菌刺激后，Prx-4在血細胞中的表達量分別在6 h和48 h出現(xiàn)兩次明顯上調(diào)，分別升高為刺激前的5.7和28倍。以上實驗結(jié)果表明Prx-4作為抗氧化酶可能在減少短蛸因抵御病原微生物侵染所產(chǎn)生的過氧化物方面發(fā)揮重要的作用。
　　Serpin型絲氨酸蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，在抑制蛋白酶有害水解和多種生理活動中具有重要作用。OoSerpin編碼基因的cDNA序列全長為1

6、735 bp，包括5’ UTR214 bp，3’ UTR282 bp，ORF1239 bp，共編碼412個氨基酸；OoSerpin的理論等電點為8.52，預(yù)測分子量大小為46.5 kDa；氨基酸序列1(M)-25(S)為信號肽，49(A)-410(P)為SERPIN結(jié)構(gòu)域。
　　采用熒光定量PCR檢測了OoSerpin在健康短蛸不同組織以及受到鰻弧菌或藤黃微球菌浸浴刺激的血細胞中的表達規(guī)律。結(jié)果表明，OoSerpin在短蛸各個檢測

7、組織器官中都有表達，其中在肝胰腺中表達量最高，其次在系統(tǒng)心中的表達量較高，而在外套膜中的表達量最低，兩者相差約760倍。在鰻弧菌刺激后，短蛸血細胞中的OoSerpin表達量在刺激后24 h顯著升高，在刺激后48 h上升至最高，為刺激前的85倍。而在藤黃微球菌刺激組中，OoSerpin的表達量在刺激后6和12 h就分別顯著上升為刺激前的4和3倍；在24 h上升到最高，為刺激前的26倍；在48 h又有所下降，為刺激前的14倍。
　　將

8、OoSerpin編碼區(qū)成熟肽克隆入pEASY-E1表達載體中，后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Transetta（DE3）表達菌中，經(jīng)1‰IPTG誘導(dǎo)表達4 h后，純化并復(fù)性后得到重組蛋白rOoSerpin，分析其對胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用及對大腸桿菌生長的抑制作用，結(jié)果表明，960μg rOoSerpin分別與50μg胰蛋白酶或25μg糜蛋白酶混合孵育30分鐘后，能分別抑制86.5%和55.0%的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。此外，rOoSerp