擬南芥AtCYSb相互作用蛋白的篩選及生物學(xué)功能研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號：B15020學(xué)位論文擬南芥AtCYSb相互作用蛋白的篩選及生物學(xué)功能研究指導(dǎo)教師姓名：申請學(xué)位級別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：郭坤元柳參奎教授東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)2015年3月論文答辯日期：2015年06月東北林業(yè)大學(xué)授予學(xué)位日期：2015年06月答辯委員會主席：論文評閱人：聾宣冬櫛素大擎摘要摘要半胱氨酸蛋白酶抑制劑普遍存在于動物，植物和微生物體內(nèi)，它在蛋白質(zhì)水解，蛋白酶活性調(diào)節(jié)等許

2、多生理過程中起著重要的作用。之前人們對半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究主要集中在抗病抗蟲害方面，但是近些年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物逆境防御過程中也起著重要的作用，因此探求和挖掘半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物逆境防御中的這種抗逆機理和潛在的作用對象具有十分重要的意義。AtCYSb是擬南芥中的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，GUS染色結(jié)果表明AtCYSb在萌發(fā)的種子，年幼的葉，花藥，種莢和成熟的葉，莖，種莢里均有表達，這表明它是植物生長周

3、期里一個十分活躍的基因。另外前期的研究結(jié)果表明它可以受鹽，堿和氧化等多種逆境脅迫的誘導(dǎo)表達，且在擬南芥中過量表達AtCYSb可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽，堿和氧化等逆境脅迫的耐受性，這說明AtCYSb在植物應(yīng)對逆境脅迫的過程中起著重要的作用。為了探求和尋找AtCYSb轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的這種抗逆機理以及它潛在的作用對象，我們對其進行了酵母雙雜交篩選并得到了一個與其具有相互作用的蛋白，鈣離子依賴性的核酸酶AtCaN2，同時利用酵母共轉(zhuǎn)化實驗，體

4、外pull—down實驗和體內(nèi)雙分子熒光互補實驗驗證了AtCYSb與AtCaN2之間的相互作用。AtCaN2的酶活性檢測實驗表明，AtCaN2對雙鏈DNA(dsDNA)，單鏈DNA(ssDNA)，環(huán)形質(zhì)粒，rRNA，mRNA和tRNA等多種底物均具有降解能力，且AtCaN2降解RNA的速率快于DNA。除了鈣離子之外，AtCaN2的酶活性還可以依賴鎂離子和錳離子，以及鈣離子鎂離子和鈣離子錳離子雙離子條件，但是鋅離子和金屬螯合劑EDTA可以

5、抑制AtCaN2的酶活性。點突變實驗表明AtCaN2氨基酸序列中的天冬氨酸和精氨酸位點在保持其核酸酶活性上起著重要作用。UREAPAGE實驗結(jié)果表明AtCaN2是一種從3端往5，端酶解的外切核酸酶。另外實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，AtCaN2的酶活性可以一定程度上被AtCYSb的抑制，這迸一步說明了AtCYSb和AtCaN2之間存在著相互作用關(guān)系。AtCaN2的生物學(xué)功能研究表明，AtCaN2也可以受鹽，堿，滲透和氧化等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達，同時