簡介：疾病控制與預防中心報道在美國腎臟疾病已成為第九大主要死因。盡管傳統的腎替代治療如血液透析、血液濾過及腹膜透析都能成功用于長期治療慢性腎衰竭但仍然有高的死亡率?，F有的生物人工腎小管輔助裝置BIOARTIFICIALRENALASSISTDEVICERAD克服了傳統透析技術只替代了腎小球的功能而忽略了腎小管功能的缺陷。體外實驗證明該裝置能很好地發(fā)揮腎小管的功能被美國食品藥品管理局批準進入ⅠⅡ期臨床實驗。但因所采用的透析膜材料為高分子聚合物薄膜該材料固有的疏水性表面限制了其應用另外其孔密度較低不便于裝置的微小化及體內移植。TIO2納米管陣列由于其優(yōu)異的生物相容性、親水性及特殊的管狀結構近年來在生物醫(yī)學領域引起了廣泛關注。本文探索采用排列規(guī)整、兩端通透及較高孔密度的TIO2納米管陣列薄膜作為透析膜材料以克服高分子聚合物薄膜的缺陷。能否將腎臟細胞較好的黏附于TIO2納米管材料并使其發(fā)揮腎臟的生理功能目前還沒有公開的文獻報道。本文采用陽極氧化法制備了兩端通透的TIO2納米管陣列通過控制陽極氧化電壓獲得了4種不同管徑的納米管材料將每種材料分別經未退火未光照、未退火光照、退火未光照及退火光照處理并在其上分別種植腎小管上皮細胞株LLCPK1和血管內皮細胞株ECV304。在此基礎上詳細研究了TIO2納米管材料的幾何形貌參數、晶型結構及光催化活性等對兩種細胞的黏附及增殖影響規(guī)律。利用熒光顯微鏡考察了TIO2納米管陣列有序生物透析膜組織工程構建中細胞材料之間的相互影響規(guī)律采用MTT方法檢測了黏附細胞的活性及增殖同時使用掃描電鏡觀察了LLCPK1細胞及ECV304細胞的生長形態(tài)。在獲取了各單種細胞最佳的生長條件參數之后考察了混合細胞之間的相互作用機理研究了膠原蛋白和動態(tài)剪切力對單種細胞及混合細胞的黏附、增殖的影響規(guī)律并對制備的透析膜材料進行了初步的重吸收功能檢測。研究結果表明管徑為70NM且退火未光照的TIO2納米管陣列膜最有利于LLCPK1細胞及ECV304細胞的黏附及增殖掃描電鏡觀察顯示LLCPK1細胞在TIO2納米管上的生長形態(tài)多呈鵝卵石樣并延伸出很長的偽足且細胞表面附著密集的微絨毛ECV304細胞在納米管上呈圓形。細胞混合種植能較好地促進各單種細胞的黏附生長混合細胞的活性要高于兩單種細胞在材料表面包被膠原蛋白能明顯改善內皮細胞的黏附、增殖但對上皮細胞的影響不大動態(tài)剪切應力可明顯提高增殖活性且使細胞分布更均勻有利于細胞形成單層狀功能檢測實驗證實兩種細胞能在TIO2納米管陣列上存活且能發(fā)揮腎臟的重吸收功能。這為利用組織工程構建具有復合功能的生物人工腎提供了良好的實驗基礎。

簡介：人們長期以來為了尋求一種最佳的血管替代物，嘗試了自體動靜脈、人工材料、生物材料等多種方法，但這些方法均存在一些不足。組織工程概念的提出及技術的逐步成熟使在體外培植具有生物活性，結構、功能與自體血管相類似的人工血管成為可能。本實驗培養(yǎng)內皮祖細胞和豬主動脈平滑肌細胞為種子細胞，脫除豬主動脈血管壁細胞獲得脫細胞血管基質，為下一步構建組織工程血管提供細胞和支架材料。目的1獲取內皮祖細胞和平滑肌細胞，為構建組織工程血管提供種子細胞；2制備脫細胞血管基質，為構建組織工程血管提供支架材料。方法1無菌條件下采集豬外周血，肝素抗凝，經淋巴細胞分離液相對密度為1077GML，密度梯度離心分離外周單個核細胞，貼壁培養(yǎng)，獲得內皮祖細胞EPCS并傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下IM形態(tài)學觀察及免疫組織化學IHC鑒定；無菌條件下取豬胸主動脈，采用改良組織塊法分離培養(yǎng)豬主動脈平滑肌細胞，進行形態(tài)學觀察及免疫組織化學IHC鑒定。2采用胰蛋白酶、低滲溶液、化學除垢劑法處理豬胸主動脈來獲得脫細胞血管基質，并對萁進行組織學觀察和生物學性能測試及保存實驗。結果1成功的培養(yǎng)出內皮祖細胞并傳代。剛分離出的單個核細胞小且圓，瑞氏染色呈藍紫色，至生長6天時呈現內皮樣改變，倒置顯微鏡下內皮細胞呈“鵝卵石”形態(tài)，CD31，CD34，FLK1和VWF免疫熒光染色為陽性，以及FITCULEXLECTIN和DILACLDL免疫熒光均陽性；成功分離培養(yǎng)出平滑肌細胞，呈典型的“峰一谷”狀，平滑肌細胞肌動蛋白抗體。2成功獲得脫細胞血管基質，HE染色和掃描電鏡觀察可見脫細胞組織基質中細胞已全部脫除，膠原纖維和彈性纖維保持原來的形態(tài)和結構，呈條索狀排列，細胞已全部去除，基底面完整，透射電鏡下可見膠原纖維橫紋；其膠原蛋白含量和力學性狀與新鮮組織無明顯差別。結論1所培養(yǎng)的內皮細胞和平滑肌細胞可為組織工程血管的研究提供細胞來源；2所制備的脫細胞血管基質可為組織工程血管的研究提供支架材料。

簡介：第四軍醫(yī)大學學位論文骨組織工程體內生物反應器模型的制作和初步檢測（題名和副題名）分類號密級國際十進分類號（UDC）石志遠（作者姓名）指導教師姓名王臻教授（主任醫(yī)師）指導教師單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科申請學位級別碩士專業(yè)名稱外科學（骨科學）論文提交日期200904答辯日期200905論文起止時間2008年10月至2009年4月學位授予單位第四軍醫(yī)大學3骨組織工程體內生物反應器模型的制作和初步檢測骨組織工程體內生物反應器模型的制作和初步檢測骨組織工程體內生物反應器模型的制作和初步檢測骨組織工程體內生物反應器模型的制作和初步檢測研究生石志遠學科專業(yè)外科學（骨外）所在單位第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科導師王臻教授（主任醫(yī)師）輔導教師呂昌偉資助基金項目關鍵詞關鍵詞組織工程；生物反應器；動物模型中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學2009年05月

簡介：該研究擬探討VWF基因RSAI、SMAⅠ多態(tài)性與血栓性疾病的發(fā)生有無相關關系并對基因芯片技術在SNP檢測上的應用進行探討研究中我們首先建立VWF基因RSAI、SMAI多態(tài)性寡核苷酸陣列檢測方法設計、合成兩組寡核苷酸探針使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化學物質實現探針與固相支持物玻片的連接應用不對稱PCR方法擴增RSAI、SMAI多態(tài)性片段在擴增體系中摻入熒光標記DUTP獲得被測片段的單鏈標記產物對核酸雜交反應的溫度、動力學和離子濃度變化進行研究獲得最佳的雜交鑒別條件隨機抽取20名正常人酶切法確定多態(tài)性基因型再用寡核苷酸陣列法檢測以驗證該方法的準確性使用該方法對50例血栓病人進行檢測探討血栓性疾病的發(fā)生與VWF基因RSAI、SMAI多態(tài)性的關系結果表明寡核苷酸陣列法和酶切法對20例標本檢測的符合率為100﹪血栓病人與正常人之間兩位點多態(tài)性的基因型和等位基因頻率的差異均無顯著意義（P005）因而該研究成功建立VWF基因RSAI、SMAI多態(tài)性寡核苷酸陣列檢測方法為基因芯片技術在SNP檢測上的應用提供依據同時也對遺傳性疾病的高效診斷途徑進行了成功探索未獲明確證據表明RSAI、SMAI多態(tài)性與血栓的發(fā)生有關

簡介：本文介紹了膨脹土對土木工程巨大的影響和危害，以及目前常用的預防和處理膨脹土病害的化學改性方法。而地球表面的土體里含有豐富活躍的微生物，是地質環(huán)境中重要的組成部分。通過對膨脹土的脹縮機理、化學改良機理及微生物特性的分析發(fā)現，將微生物引入到膨脹土的土性處理中是可行的，且具有巨大的經濟效益和工程意義。本研究從膨脹土的脹縮性質、改性機理出發(fā)，由土中分離出適宜的菌株，制成固體菌劑。將制好的微生物菌劑添加到膨脹土中，經過標準培養(yǎng)后，以自由膨脹率為判定標準進行初篩，篩選出4株使膨脹土自由膨脹率有明顯降低的菌株。并對這4株菌株作用后的膨脹土進行直剪試驗和其他脹縮性試驗無荷載膨脹量、有荷載膨脹量、膨脹力和收縮試驗，由此試驗結果對菌株進行復篩，得到1株篩選株暫時定名A。為得到篩選株A對膨脹土工程性質的影響，通過多項試驗研究了摻入A前后的膨脹土在培養(yǎng)不同天數后的脹縮特性、強度特性等方面的變化，同時借助X射線衍射、掃描電鏡測試技術，研究了膨脹土在微生物作用下礦物成分和細觀結構的變化，為下一步揭示微生物改變膨脹土工程性質的機理研究提供了試驗基礎。

簡介：本文嘗試運用SHOTGUN蛋白質組學研究技術和策略解決生物工程中的問題首先將蛋白質組學應用于抗生素代謝途徑的研究；其次將蛋白質組學應用于腫瘤生物標志物和潛在藥物靶標的尋找；在此基礎上引入O同位素標記技術定量地考察K562細胞調亡過程中蛋白質組的變化結果如下運用2DLCMSMS分析了藤黃灰鏈霉菌抗生素生產期菌株103和CNNL的總蛋白分別得到726和809個蛋白運用生物信息學手段結合實驗室研究結果將所有可能的代謝途徑關鍵酶在所構建的數據庫中進行搜索兩個菌株中均發(fā)現有聚酮合成途徑的關鍵酶聚酮合成酶和其它幾個與該途徑相關的酶說明麥拓萊霉素通過聚酮合成途徑合成結合Β酮酯酰合酶的抑制劑實驗結果說明以上結論的正確性展示了蛋白組學在尋找生物合成途徑方面的價值基于SHOTGUN、一維凝膠電泳預分離策略分離鑒定了K562細胞總蛋白提取物得到1707個蛋白運用生物信息學手段對腫瘤生物標志物和藥物靶標進行了預測表明MLL3、SET、DEK、STATHMIN、NUCLEOPHOSMIN等蛋白可能為潛在的生物標志物或治療腫瘤和白血病的藥物作用靶點通過亞細胞分級、一維凝膠電泳、串聯質譜分析了K562細胞核蛋白質共鑒定了334個蛋白其中檢測到了與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷相關的重要基因產物包括NF45PROTEIN、PIBF1、DDX48、IKAP等蛋白提供了可深入研究的腫瘤相關分子靶標采用180同位素標記法定量比較了多烯紫杉醇誘導K562細胞凋亡過程中可溶性蛋白質組的變化在所分析的86個蛋白中46個蛋白表達量沒有發(fā)生變化15個蛋白表達量下調包括SET蛋白、延長因子EEF1A1等；20個蛋白表達量上調包括Α烯醇酶、過氧化物還原酶等這些被抑制和被激活的蛋白可能為腫瘤生物標志物和藥物作用靶點為腫瘤的診斷和治療提供了新的候選蛋白

簡介：山西醫(yī)科大學碩士學位論文NK4因子原核基因工程表達體系的建立及抗腫瘤生物學活性研究姓名馮仟佳申請學位級別碩士專業(yè)生物化學與分子生物學指導教師牛勃20060528ABSTL‘ACTOBJEC舡VE1．TOEXPRESSNK4INESCHERCHIACOH2．TOSEPARATEAILDPURI母NK43．TODETECTTHEACTIVITYOFNK4ANTAGONJZINGTILMORMETHODSWEHAVEPR印AREDANOVDKINDOFPROTEINFACTO卜NK4WHICHCAN鋤TA90NIZETL】M0T鯽DBLOODVESSD舯WTLLINECD，IBL21．WEHAVEDETECTEDTHEACTIVI夠OFNK4ANTAGOLLI五NGMMORBY加VF舳EXP幽ENT．111EEXPERIMELLTCONSISTSOFDETECTINGTHESELECTJONE艉CTOFNK4HLLINGTLLMORCELLBYMTTMEMOD，NK4’SDI婦ENTSUPPRESSIONEFFECTSTOTILIILOR’SINV枷NGBAS鋤ENTM御BR卸E，NK4’S加CDONSOFSUPPRESS曲GB16BL6STICLINGTOBASEMENTMEMBRANE，SU】PRESSINGNMMCELLMOVINGDITECTLYANDSUIPIESSINGRATCAPILLARYBLOODVESSD’SFOM撕ON．RESULTS1．NK4WASEXPRESSEDINECD矗SUCCESSFLLNY．2．NK4WASS印ARATED，P誠FIEDANDRENATLLRED．3．THEACTIV耐OFNK4SUPPRESSINGT哪ORCDLINVADINGA11DMETASTASISWASCONFIRNLED．CONCIUSIONWEHAVEEXPRESSNK4I11EC0矗SUCCESS向1LYANDH“EGOTⅡ1EBESTOPERATINGCONDITIONSINLABORATORYOFTHECXPRCSSIONSYST鋤ANDMENHAVEPRODUCEDPURENK4．111VASIOⅡAILDMETASTASISARETHEMOSTINTRINSJCQUALITIESOFMALIGN趼TTUMORS．HOWTOPREVENT柚DTREATTHEMISON。FOC旺S曲OUTCANCER．BY加VF加EXP舐MELLT，WEHAVECON蠡HNEDTHEACTIVNYT11ATNK4CANSUPPRESSTUMORCENINVADINGA11DMETASTASIS．THISHAVELAIDEXPERIMENTALANDTHEORETICALBASESFORDEVELOPINGBIOCH鋤ICALPHAⅡNACEUTICALSINCLINICAL6ELD．KEYWORDSNK4，GENEENGINEERIN昌BI010西CALACTIVITY，SUPPRESSTL】MORINVASIONA11DMETASTASISJL

簡介：點擊查看更多工程菌生物轉化D-型氨基酸的研究——D-海因酶基因的克隆、表達、純化及其性質.pdf精彩內容。

簡介：在了解天然產物生物合成途徑以及相關基因信息的基礎上，人工改造調控基因，或者實現相關基因簇的異源表達，從而獲得具有新結構新活性的抗生素，是鏈霉菌代謝工程改造的兩個重要途徑。TALLYSOMYCINTLMH1是由TLMH基因失活后的工程菌SHINDUSTANUSSB8005合成的主要產物。它作為糖肽類抗腫瘤抗生素TLM和BLM的新型類似物，具有與母體相似的DNA切割活性。然而，這種新型抗生素在工程菌中的低產量極大地限制了對其活性和應用的進一步研究。本研究旨在通過采用各種有效的方法來優(yōu)化TLMH1的培養(yǎng)基組分，并進行發(fā)酵放大提高其產量。文章結合單因素優(yōu)化，PLACKETTBURMAN設計和響應面實驗等方法來進行優(yōu)化，結果顯示CUSO4，麥芽糖，DGS是培養(yǎng)基中3個最重要的影響因子，統計學分析確定最佳培養(yǎng)基后，相應的上罐放大發(fā)酵最高產量為2499MGL，比原始培養(yǎng)基的產量高出268倍，比原始菌TLM的產量高出129倍。經AMBERLITEIRC50離子交換樹脂和DIAIONHP20大孔樹脂上柱分離后，HPLC分析純度可達到95％以上。RAPAMYCINRAP是一種由吸水鏈霉菌合成的大環(huán)內酯抗生素。盡管其生物合成途徑已得到全面深入的研究，但其詳細的合成機制尤其是調控機理并未完全明了，極大地阻礙了RAP產量的提高和新型衍生物的產生，以及其工業(yè)化生產和應用。本文在構建三種RAP異源生產系統的基礎上，首先用生物分析方法檢測各系統中RAP異源生產的情況，結果表明僅SALBUS2811顯示出與RAP相似的抗菌活性，而HPLC和LCMS分析并未檢測到RAP，添加重要前體L賴氨酸也無明顯作用。隨后的RTPCR分析結果表明絕大部分的RAP基因在SALBUS中未被正常轉錄，只有下游的RAPG，RAPF和RAPD顯示轉錄信號，5個可能的RAP調節(jié)基因中僅有RAPG正常轉錄，因此RAP基因表達調控的不足或不當很可能是限制基因簇正常轉錄的重要原因。通過這些基因轉錄表達情況的研究，我們可深入了解RAP生物合成的調控機理，為最終實現高產奠定基礎。

簡介：基于節(jié)能的需要以及人們對照明質量要求的不斷提高半導體照明光源以其高效節(jié)能、長壽命、色彩豐富和環(huán)保等特點受到了人們的廣泛關注。本文對發(fā)光二極管LED陣列應用于生物醫(yī)學工程的計算和設計進行了探討和研究。發(fā)光二極管LED光源技術近年來在醫(yī)療技術領域中的發(fā)展較為迅速主要是在理療、美容、保健等領域的應用比較廣泛。依據LED在醫(yī)療領域的應用特點將其應用技術進行分類重點從醫(yī)用照明醫(yī)療診斷和LED光療三個方面加以說明分析。文中結合軟件和照明算法提出的對LED陣列照明進行計算機仿真設計的思路是一種事前估計在照明器制造出以前就可以分析其光學特性是否符合照明標準減少了人力和物力的消耗縮短了設計和制造周期提高了經濟效益。論文首先論述了LED照明發(fā)展概況、LED光源的特性、驅動電路的設計對LED光源在照明中的應用作了深入探討。接著對LED照明設計中的相關計算主要是對照度計算和光通量計算的方法進行了總結和編程計算根據疊加原理推出了兩個LED光源在平面上產生照度的公式根據相同的原理進一步推出多個LED光源產生照度的計算方法。對不同半光強角以及不同功率的LED單元陣列應用于醫(yī)學領域的設計進行了探討的基礎上進一步研究了LED陣列呈矩形、內圓柱面及外圓柱面等特殊排列的分布根據不同排列分布得出不同LED陣列照度分布仿真圖像并且根據圖像對不同LED陣列進行分析總結比較各種陣列的特點分析出適合此陣列的應用領域。最后實際設計智能化的LED驅動系統并且設計了手術無影燈和新生兒黃疸治療儀等兩個實際應用的系統。相關成果可為LED醫(yī)學應用的設計和研究提供依據。

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簡介：在微生物的篩選過程中，95％的菌株在現有篩選模型下不顯示任何生物活性的菌株。如何有效合理利用這些菌株，是眾多學者關注的問題。本文利用核糖體工程技術對這些菌株二次開發(fā)，對開拓海洋微生物藥用新資源的方法學進行了探討。本實驗以一株沒有抗腫瘤活性的海洋放線菌玫瑰黃鏈霉菌為出發(fā)菌株，采用引入抗生素氯霉素，鏈霉素抗性的方法，即核糖體工程技術，進行誘導突變，共獲得有抗生素抗性的突變株270株。突變株的菌落形態(tài)、孢子顏色以及代謝產物與母體菌株有顯著的差異。對突變株的發(fā)酵產物利用小鼠乳腺癌細胞TSFT210，以細胞周期抑制、細胞凋亡誘導及壞死性細胞毒活性為指標，進行活性篩選，共獲得有顯著抗腫瘤活性的突變株3株。對其中一株活性較好的突變株STR3054進行大量發(fā)酵，采用活性追蹤的方法對其發(fā)酵產物的活性成分進行初步分離，共獲得6個單體化合物；利用波譜學方法闡明了其中5個化合物的結構，分別為鄰苯二甲酸二異丁酯，丁烯二酸二2乙基正己酯Z，R，R，次黃嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，環(huán)PROGLY二肽；其中丁烯二酸二2乙基正己酯Z，R，R為新化合物。利用TSFT210細胞鏡檢，流式細胞術和SRB法對化合物進行活性評價，其中4個化合物表現出一定的壞死性細胞毒活性，1個化合物表現為細胞周期抑制活性。對該菌株突變前后的核糖體S12蛋白編碼的基因RPSL進行PCR擴增表達，將表達產物轉入大腸桿菌DH5A，進行測序。比較菌株突變前后的RPSL序列差別，發(fā)現該段基因并沒有發(fā)生點突變，推測可能存在其它突變位點影響該菌株的鏈霉素抗性，尋找新突變點的研究有待于進一步深入。該測序結果通過GENBANK的查找，與STREPTOMYCESFILAMENTOSUSS12蛋白對應的RPSL基因有97％的相似度，證明本實驗克隆得到的序列正是RPSL基因。綜上，本文利用核糖體工程技術首次對沒有抗腫瘤活性的海洋放線菌進行誘變，得到具有顯著抗腫瘤活性的突變株。對該突變株的代謝產物進行初步研究，得到具有抗腫瘤活性的單體化合物，實驗結果證實了利用該方法開拓海洋微生物藥用資源的可行性。利用核糖體工程技術對自然界的無活性微生物進行誘導，激活微生物潛在的基因資源來獲得活性菌株，該方法的成功應用將極大的拓展微生物藥用新資源。

簡介：奎尼酸是一種具有極高價值的精細化工產品和醫(yī)藥中間體，在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、化工等行業(yè)均有較大的用途。本研究是將代謝工程技術應用于產奎尼酸基因工程菌的構建。根據代謝工程原理系統分析了細胞代謝網絡，并利用DNA重組技術合理設計細胞代謝途徑及其遺傳修飾，進而完成細胞特性改造。目的是在大腸桿菌中構建奎尼酸生物合成途徑，將碳代謝流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。利用大腸桿菌莽草酸途徑合成新的代謝物奎尼酸，需要提高上游幾種代謝中間產物PEP、E4P、DAHP、DHQ的含量，與之對應的編碼其合成酶的幾種基因分別是PPSA、TKTA、AROG、AROB。另外須在宿主細胞引入編碼與奎尼酸合成有關的異源酶基因擴展代謝途徑，然后串聯表達酶基因，同時適量增加不同種屬的多個關鍵酶的有效含量，改善限速反應。利用同源重組進行基因整合和基因破壞，改造染色體結構定向改變微生物代謝途徑。本文主要從以下幾個方面對奎尼酸基因工程菌進行了改造1編碼奎尼酸脫氫酶的QUTB基因是來自于構巢曲霉。在現有的基礎上構建了一系列包含QUTB基因的表達重組質粒。SD序列與起始密碼子不同距離的PBVQUTB1，PBVQUTB2；具有QUTB雙拷貝三基因串聯的PBVQUTBQUTBAROG；具有PPSA、TKTA、QUTB三基因串聯的PBVPTB，以及新構建的單基因重組質粒PETQUTB，PBVTACQUTB，PTRCQUTB。并對含有QUTB基因的一系列重組質粒在大腸桿菌中進行了表達與否的驗證。結果顯示PTRCQUTB，PBVTACQUTB沒有特異的蛋白表達帶，說明PTRC99A和PBVTAC載體不適合用于QUTB基因的表達。PETQUTB經過IPTG誘導后有特異的蛋白表達，并且在25小時內隨著時間的延長而增加，但是時間更長7H則因為蛋白降解而出現表達蛋白減少的跡象。PBVQUTB1和PBVQUTB2同本實驗室保存的PBVQUTB沒有出現明顯的蛋白表達量上的差異，這說明利用PBV220表達載體表達QUTB基因，起始密碼子與SD序列之間距離的遠近并不是影響其表達量的關鍵。含有兩個QUTB基因和一個AROG基因的多基因串連質粒PBVQUTBQUTBAROG，經過熱誘導，也出現了非常明顯的表達條帶。2對含有QUTB基因在大腸桿菌中可以表達幾種重組質粒進行酶活測定，與含有PBVQUTB的對照菌相比，含有PBVQUTB1，PBVQUTB2的菌株的奎尼酸脫氫酶的酶活沒有明顯變化，三基因串聯的PBVQUTBQUTBAROG甚至出現了酶活降低的現象。3成功地從粗糙脈孢菌的基因組中克隆了奎尼酸脫氫酶的基因QA3，并與幾種表達載體連接得到了PBVQA3、PETQA3、PBVTACQA3、PTRCQA3，但是這些質粒重組子在大腸桿菌中均沒有觀察到該基因的特異表達條帶。4結合QA3基因的密碼子的特點和計算機模擬的MRNA二級結構，對AQ3基因的密碼子和MRNA二級結構進行改造，優(yōu)化該基因的密碼子結構，降低形成MRNA二級結構的自由能，得到新的基因QA3RG。構建的PBVQA3RG重組質粒在大腸桿菌中成功的表達了奎尼酸脫氫酶，酶活也比對照明顯提高。同時還構建了PPSA、TKTA、QA3RG三基因串聯的重組質粒PBVPTA。5成功的構建了PUCDK、PUCDAK、PUCDBK并制備了線性化片段DK、DAK、DBK，為基因敲除和基因替換做好了準備。利用RED重組系統成功的地進行了基因敲除和基因替換，并穩(wěn)定了敲除和替換菌株的基因型，把這株菌株定名為大腸桿菌31K。6成功的構建奎尼酸發(fā)酵的工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通過實驗室搖瓶初步發(fā)酵，在硅膠板上可以初步確定，菌株AP31BKPBVPQLA產生的奎尼酸量最大，也最穩(wěn)定。7將菌株AP擴大搖瓶發(fā)酵的規(guī)模，然后經過樹脂富集，HPLC制備，得到了微量的奎尼酸樣品。經過紅外光譜、核磁共振、電子噴霧質譜以及紫外、液質聯用等的鑒定可以確定與奎尼酸標準品無差異，由此可以確定我們利用生物合成并且分離鑒定了奎尼酸?？傊瑸榱撕铣煽崴岵⑻岣咂洚a量，本研究從分子進化、基因重組、網絡構建等不同的方面對奎尼酸生物合成進行了許多有益嘗試，既為研究奎尼酸的生物合成奠定了基礎，也為基因工程應用于代謝工程提供一定的借鑒意義。

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簡介：湖北工業(yè)大學碩士學位論文石油微生物基因工程菌的構建姓名葉長春申請學位級別碩士專業(yè)發(fā)酵工程指導教師汪浩勇20090501湖北工業(yè)大學碩士學位論文ABSTRACTPETROLEUMISTHELIFEBLOODOFTHEINDUSTRIALWORLDANDECONOMICDEVELOPMENTWHILETHEDEVELOPMENTANDUTILIZATIONOFPETROLEUMRESOURCESALEFACEDWITHASERIESOFSERIOUSPROBLEMSMICROBIALERDAANTEDOILRECOVERYISOILEOFTHESOLUTIONSTOTHESEPROBLEMSNOWADAYS，THEMAINWAYOFOBTAININGPETROLEUMMICROORGANISMSISFIOMNATURALSELECTIONORTHEDIRECTUSEOFTHEMICROORGANISMSINOILBUTNATURALPETROLEUMMICROBEISNOGOODATACIDRESISTANCE，HIGHTEMPERATUREANDHIGHSALTTOLERANTINORDERTOSOLVETHISPROBLEMTHISSTUDYCONSTRUCTEDOPERONMB7INECOLIBYUSINGTECHNIQUESFORGENEENGINEERINGANDTHENOPERONMB7WASSUCCESSFULLYINTEGRATEDINTOTHEOILMICROBIALGENOMETHROUGHTRANSPOSITIONUSINGORIGINALSTRAINHTLB5PNASCONTR01THETRANSPOSITIONPOSITIVEOILMICROBESHOWEDAHIGHDEGREEOFRESISTENCETOACIDANDHIGHTEMPERATURE耽ERESEARCHPROVEDTHATMB7MAYSIGNIFICANTLYIMPROVEOILMICROBIALRESISTANCEONACIDANDITSRESISTANCEONHIGHTEMPERATUREPRELIMINARYTHEPAPEL“EXPLORESTHECONSTRUCTINGMETHODOFGENEENGINEERINGBACTERIAOFPETROLEUMMICROBE，TOANALYSETHEIMPACTOFHEATSHOCKPROTEINONPETROLEUMMICROBEINADVERSITYINORDERTOFURTHERCONSTRUCTHIGHACIDRESISTANCE，HIGHALKALIANDHI【GLASALTTOLERANTMICROORGANISMS，THISSTUDYPARTIALLYDIGESTEDSAU3ACHROMOSOMALOFPETROLEUMMICROBEINSERTEDBEFORETHENONPROMOTERCHLORAMPHENICOLRESISTANCEGENEANDESTABLISHEDGENEDATABASEUSINGTHEEHLORAMPHENICOLRESISTANTLBPLATE，THECHLORAMPHENICOLRESISTANTSTRAINSWEREIDENTIFIEDUSINGTHISMETHODSUCCESSFULLYFROMPETROLEUMMICROBEHUB5PNISOLATEDHUB5PNPROMOTERHUB5PNPROMOTERCANSIGNIFICANTLYINCREASETHERESISTANCETOCHLORAMPHENIC01THESUCCESSFULISOLATIONOFPROMOTERSEQUENCESOFPETROLEUMMICROBEHAS1AIDALIABLEANDPRACTICALFOUNDATIONFORTHEFURTHERCONSTRUCTIONOFE伍CIENTGENEENGINEERINGBACTERIUMOFPETROLEUMMICROBEKEYWORDSHSP，HEATSHOCKPROTEIN，PETROLEUMMICROBE，PLASMID，GENEENGINEERINGN