黑帶蛙(Rana nigrovittata)皮膚抗菌肽的分子多樣性、結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、大量研究已經(jīng)證實(shí)，兩棲類動(dòng)物皮膚是生物活性物質(zhì)豐富的資源庫(kù)。而抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)作為機(jī)體先天防御系統(tǒng)的重要組成部分，在兩棲類皮膚分泌液中含量異常豐富.本研究中，我們以來源于中國(guó)云南西雙版納的一種蛙科動(dòng)物黑帶蛙(Rana nigrovittata)為試驗(yàn)材料，研究其皮膚分泌液中抗菌肽的分子多樣性并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。 通過兩步分離純化：Sephadex G-50凝膠過濾層析和反相

2、高壓液相層析(RP-HPLC)，我們從黑帶蛙皮膚分泌物中初步分離到兩種抗菌肽，與大多數(shù)蛙科來源的抗菌肽一樣，它們C末端均有由二硫鍵形成的七肽環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并因含有多個(gè)堿性氨基酸殘基而使整個(gè)分子帶正電荷，通過同源性比對(duì)并根據(jù)抗菌肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其分別命名為Nigroain-A1和Rugosin-RN1.為了進(jìn)一步研究黑帶蛙皮膚分泌液中抗菌肽的分子多樣性，以對(duì)應(yīng)編碼蛙科抗菌肽前體信號(hào)肽區(qū)域從起始密碼子開始的7個(gè)氨基酸殘基的堿基序列為引物，從構(gòu)建的

3、單個(gè)黑帶蛙皮膚cDNA文庫(kù)中篩選抗菌肽的編碼基因，我們共篩選到了199個(gè)編碼抗菌肽的克隆。其中編碼不同抗菌肽前體的cDNA序列共167條(Genebank登錄號(hào)為EU136401- EU136567)，這167條序列共編碼45個(gè)新的抗菌肽.根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將它們歸于15個(gè)不同的抗菌肽家族，其中有21個(gè)抗菌肽分別屬于Rugosin-RN、Gaegurin-6-RN、Temporin-RN和Brevinin-2-RN這4個(gè)已知的蛙科來源的

4、抗菌肽家族，其余24個(gè)與已知的抗菌肽相似性較低，我們將它們歸類到11個(gè)新的家族，分別命名為Nigroain-A，-B，-C，-D，-E，-F，-G，-H，-I，-J，-L。這些新型抗菌肽大致可分為兩類，線性肽和含分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)狀肽，且以環(huán)狀肽居多，這與以前從蛙科動(dòng)物分離到大量環(huán)狀肽而線性肽較少的研究結(jié)果相一致。根據(jù)家族內(nèi)及家族間抗菌肽序列及結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，我們認(rèn)為，黑帶蛙皮膚抗菌肽的分子多樣性可能是通過點(diǎn)突變、堿基的插入或刪除、結(jié)構(gòu)域

5、的穿梭以及拼接等多種機(jī)制形成的。這15個(gè)家族抗菌肽的前體編碼單一拷貝的成熟肽，其SPD區(qū)域(包括信號(hào)肽和前導(dǎo)肽，Signal and Propiece Domain，SPD)都非常保守，而MD區(qū)域(成熟肽區(qū)域，Maturepeptide，MD)卻變化很大，說明這些抗菌肽相關(guān)基因形成了一個(gè)起源于共同祖先的多基因家族，這也是導(dǎo)致兩棲類抗菌肽多樣性產(chǎn)生的分子機(jī)制之一。 對(duì)來自黑帶蛙皮膚抗菌肽生物功能的分析表明，這些結(jié)構(gòu)多樣的抗菌肽，

6、生物功能也表現(xiàn)出多樣性。首先它們具有廣泛的抗菌譜和高效的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌包括兩者耐藥菌株和真菌具有很強(qiáng)的殺滅作用；還普遍具有促進(jìn)肥大細(xì)胞脫粒、促或抗組胺釋放功能；相當(dāng)一部分抗菌肽具有對(duì)自由基的清除能力和對(duì)Fe3+的還原力，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化活性；還發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性和凝集紅細(xì)胞活性的抗菌膚；此外，有些抗菌肽還表現(xiàn)出溶血活性。特別是有些抗菌肽類似物已經(jīng)失去抗菌活性，卻表現(xiàn)出促進(jìn)肥大細(xì)胞脫粒或抗組胺釋放

7、活性及抗氧化的功能。對(duì)這些抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析表明，氨基酸殘基的個(gè)別突變對(duì)抗菌肽功能的影響非常明顯，我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示可以改變抗菌肽抗菌譜的范圍，對(duì)微生物的敏感程度；可以使溶血活性從強(qiáng)到弱：可以使抗氧化活性由無(wú)到有?？梢哉f，單一的突變就可能很大程度上改變抗菌肽的生物活性。 我們?cè)诤趲芷つw發(fā)現(xiàn)一種同時(shí)具有抗菌活性，凝集兔血細(xì)胞和凝集細(xì)菌的功能，以及胰蛋白酶抑制劑活性的小分子多功能活性肽，Nigroain-A1.其僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性

8、菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有抗菌活性，但能迅速引起革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌及真菌的凝集，對(duì)兔紅細(xì)胞的最小凝集濃度為15μg/ml，對(duì)胰蛋白酶的抑制常數(shù)為Ki=5.26×10-6 M；而且這種小分子活性肽在黑帶蛙皮膚內(nèi)含量豐富。這種多種活性集于一種小分子肽的現(xiàn)象推測(cè)主要是作為兩棲類的一種集約型的防御機(jī)制。根據(jù)Nigroain-A1前體結(jié)構(gòu)與抗菌肽前體序列的相似性以及三種生物活性物質(zhì)都起到防御保護(hù)作用這一功能