微生物脅迫下東北林蛙皮膚抗菌肽和功能蛋白差異表達的研究.pdf

1、學校代碼：10225學號：B12035學位論文微生物脅迫下東北林蛙皮膚抗菌肽和功能蛋白差異表達的研究指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：肖向紅馬建章院士博士東北林業(yè)大學東北林業(yè)大學學科專業(yè)：野生動植物保護與利用論文答辯日期：授予學位日期：答辯委員會主席：論文評閱人：圣夕厶櫛素大學摘要摘要兩棲類動物的皮膚在長期進化過程中形成了以抗微生物活性肽為主要成分的比較完善的機體先天免疫防御系統(tǒng)，用以應對環(huán)境中多種微生物的侵襲。然

2、而，近年來兩棲類種群數(shù)量卻呈全球性急劇下降，其主要原因之一是由于環(huán)境中病原微生物導致的感染性疾病的暴發(fā)。雖然近年來對兩棲類皮膚活性肽進行了大量的研究，但兩棲類如何通過皮膚固有免疫防御機制和生存策略應對環(huán)境致病性微生物所帶來的威脅，以及兩棲類皮膚的先天免疫應答與環(huán)境致病性微生物之間的關(guān)系目前尚不清楚。因此，利用分子生物學、質(zhì)譜、高效液相色譜和差異蛋白質(zhì)表達等技術(shù)方法研究病原微生物對兩棲類先天免疫防御體系中皮膚活性肽分泌表達變化和規(guī)律，對于

3、揭示兩棲類在抵御病原微生物侵襲時機體所采取的固有免疫應答機制和策略提供科學依據(jù)，對處于瀕危狀態(tài)的兩棲類物種的保護具有重要的理論意義和應用價值。本研究以東北地區(qū)兩棲類的代表物種東北林蛙(Ranadybowskii)為研究對象，選擇不同致病性微生物(Ecoli、Saureus、RGV和Ahydrophila)作為環(huán)境脅迫因子，采用RPHPLC、2D電泳、ESIMS／MS、熒光定量PCR和高通量表達譜技術(shù)等，研究致病性微生物脅迫后蛙皮膚及分泌

4、物中抗菌肽和功能蛋白表達的變化，獲得新發(fā)現(xiàn)的蛙皮膚抗菌肽基因cDNA序列，并測定了皮膚中抗菌肽和Toll樣受體(TLRs)的cDNA不同時間點的表達量變化，及轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達譜的變化。本研究獲得的主要結(jié)果如下：1特定細菌脅迫下東北林蛙皮膚功能蛋白的差異表達2D電泳和NanoUPLCESIMS／MS質(zhì)譜結(jié)果顯示Ecoli、Saureus脅迫后在分泌物中共鑒定出7種有差異的功能蛋白，分別為：超氧化物歧化酶A(SuperoxideDism

5、utaseA，SODA)、激素原轉(zhuǎn)化酶l(prohormoneconvertase1，PC1)、磷蛋白1A(Phosphoprotein1A)、碳酰還原酶1(carbonylreductase1，CBRl)、膜聯(lián)蛋白A1(annexinA1，ANX—A1)、cofilin1B(CFL1B)和組蛋白4(histones，H4)。揭示上述功能蛋白可能參與東北林蛙的自身免疫過程或在免疫過程中起到調(diào)節(jié)作用。2蛙類易感細菌脅迫下東北林蛙皮膚抗菌肽

6、的差異表達Ecoli、Saureus、RGV脅迫下，RPHPLC、ESIMS／MS和N端測序結(jié)果顯示，從東北林蛙皮膚分泌物中獲得8個家族的14種多肽序列，四條為全長序列，其它為可信度較高的非全長肽段；其中抗菌肽13條，分屬Brevinina1家族、Brevinina一2家族、Ranatuerin2家族、Japonicin1家族、Dybowskin1家族、Palustrin2家族、Temperin一1家族和Bradykinin家族。表明東