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1、造血干細(xì)胞是不可或缺的,它為整個(gè)生命體提供不同階段、所有類(lèi)型的血細(xì)胞。造血干細(xì)胞的發(fā)育起源,包括位點(diǎn)、時(shí)間、調(diào)控機(jī)制等,長(zhǎng)期以來(lái)廣受關(guān)注。眾所周知,AGM區(qū)是小鼠胚內(nèi)唯一的造血干細(xì)胞發(fā)生位點(diǎn)。然而,既往研究發(fā)現(xiàn)去除AGM區(qū)之外的胚胎體細(xì)胞仍然能夠重建成年受體的造血系統(tǒng),提示胚內(nèi)可能還存在其他未知的造血位點(diǎn)。
本研究擬通過(guò)多種手段明確小鼠胚胎頭部的造血干細(xì)胞潛能和命運(yùn)。我們通過(guò)體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):E10.5時(shí),移植1.7-2.5個(gè)
2、胚胎量的AGM區(qū)細(xì)胞,大約30%(14/40)的受體長(zhǎng)期重建(>16周),嵌合率46.6%±22.4%。而移植頭部細(xì)胞,12%(5/40)的受體長(zhǎng)期重建,嵌合率57.2%±22.9%。但移植循環(huán)血細(xì)胞后,均未檢測(cè)到嵌合陽(yáng)性信號(hào)。E11.5時(shí),頭部細(xì)胞移植后,40%(8/20)的受體長(zhǎng)期重建,嵌合率54.6%±23.8%,而AGM區(qū)60%(9/15)受體長(zhǎng)期重建,嵌合率47.9%±20.9%。同時(shí),通過(guò)各系嵌合以及二次移植明確E10.5和
3、E11.5的頭部含有真正的造血干細(xì)胞,能多向分化和自我更新。通過(guò)流式分選后移植,發(fā)現(xiàn)頭部造血干細(xì)胞富集于CD34+c-Kit+細(xì)胞群。
我們利用流式技術(shù)對(duì)E9.5-E11.5小鼠胚胎頭部和AGM區(qū)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)均含有相當(dāng)比例的CD34+c-Kit+、CD41+c-Kit+、CD45+c-Kit+細(xì)胞。同時(shí),我們也利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)造血、內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)E10.5頭部的Scl、P2-Runx1、GATA2的轉(zhuǎn)錄水平是
4、相應(yīng)AGM區(qū)的1.5、1.6、2.3倍,而Tie2、CD144表達(dá)水平相當(dāng)。在Tie2+以及CD31+c-Kit+細(xì)胞群中,無(wú)論E10.5還是E11.5,頭部細(xì)胞Scl、P2-Runxl、GATA2的表達(dá)水平均與AGM類(lèi)似。
繼而,我們通過(guò)原位染色、流式分析、純化內(nèi)皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞命運(yùn)示蹤考察小鼠胚胎頭部的內(nèi)皮細(xì)胞是否具有生血潛能。首先我們采用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)E10.5的頭部緊貼動(dòng)脈內(nèi)皮層有CD31+的造血樣細(xì)胞,或成
5、簇或散在。通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn),E10.5頭部的CD31+c-Kithigh比例為0.063%-0.113%,稍低于AGM區(qū)(0.088%-0.157%)。其次,通過(guò)流式分選獲得頭部?jī)?nèi)皮細(xì)胞(CD31+CD41-CD45Ter119-),與OP9共培養(yǎng)后可產(chǎn)生CD45+的造血細(xì)胞和CD19+的B細(xì)胞,與AGM相似。應(yīng)用可誘導(dǎo)的VE-cadherin-Cre;tdTomato小鼠模型發(fā)現(xiàn),頭部細(xì)胞產(chǎn)生的一些造血簇共表達(dá)紅色熒光蛋白和CD45,
6、即tdTomato+CD45+,表明內(nèi)皮生血活動(dòng)的發(fā)生,與AGM區(qū)類(lèi)似。流式分析確認(rèn)tdTomato+細(xì)胞中的大部分為CD45+。相反,該現(xiàn)象在循環(huán)血細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)。
SP-A-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型可特異性標(biāo)記腦組織而非其它位點(diǎn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,適合用于追蹤腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的造血命運(yùn)。首先我們將E12.5的SP-A-Cre;ROSA-LacZ小鼠胚胎進(jìn)行LacZ染色,相應(yīng)的頭部切片中,發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈內(nèi)皮層和動(dòng)脈管腔內(nèi)的造血細(xì)胞有LacZ
7、陽(yáng)性信號(hào),一些LacZ陽(yáng)性的血細(xì)胞可能是通過(guò)出芽的方式由內(nèi)皮細(xì)胞層產(chǎn)生。類(lèi)似的陽(yáng)性信號(hào)在AGM區(qū)和胎肝中并未發(fā)現(xiàn)。
我們也通過(guò)原代細(xì)胞的流式分析和體外誘導(dǎo)考察SP-A-Cre;ROSA-LacZ胚胎頭部細(xì)胞的造血能力。E13.5的SPA-Cre;ROSA-LacZ頭部CD31+內(nèi)皮細(xì)胞中,10.5%為FDG+,而CD45+的造血細(xì)胞中,4.6%為FDG+。頭部的Tie2+細(xì)胞與OP9共培養(yǎng)之后,CD31+內(nèi)皮細(xì)胞中20%為FD
8、G+,CD45+造血細(xì)胞中8.4%為FDG+,造血祖細(xì)胞CD45+c-Kit+中,12.3%為FDG,B細(xì)胞(B220+CD19+)中,27.6%為FDG+。這表明:小鼠胚胎的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞具有原位生血和體外造血的能力。
最后,我們對(duì)不同年齡的SP-A-Cre;ROSA-LacZ、SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠進(jìn)行檢測(cè)以評(píng)估腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成體造血系統(tǒng)的生理貢獻(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn),出生后2周的SP-A-Cre;ROSA-La
9、cZ小鼠的骨髓,富集造血干細(xì)胞的LSK(LinSca-1+c-Kit+)亞群中,LacZ陽(yáng)性的細(xì)胞比例較低,1.1%-1.3%。4周齡小鼠的骨髓中,在富集造血干細(xì)胞效率更高的亞群,即LSKCD48-CD150+,LacZ陽(yáng)性細(xì)胞的比例為4.2%-4.5%。我們也考察了4-6周齡的SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠造血各系的情況,發(fā)現(xiàn)骨髓的LSKCD48-CD150+細(xì)胞中,EYFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例為5.9%-7.7%。骨髓和外周血各
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