葡聚糖酶cel8A和cel48B的基因克隆表達(dá)、酶活性質(zhì)及協(xié)同研究.pdf

1、本論文對Enterobacter cloacae(E.cloacae)的內(nèi)切葡聚糖酶cel8A和Bacillus licheniformis（B.licheniformis）的外切葡聚糖酶cel48B進(jìn)行研究。首先，克隆表達(dá)E.cloacae的內(nèi)切葡聚糖酶基因cel8A，研究其酶學(xué)性質(zhì)，包括最適溫度、最適pH、Km、Vmax值和比活力的測定。其次，對B.licheniformis的外切葡聚糖酶基因cel48B進(jìn)行克隆表達(dá)，對該酶作定性研

2、究，并對外切葡聚糖酶cel48B基因進(jìn)行定點突變，獲得突變酶E38Q、E49Q和D228N，將其酶活與原始酶活性進(jìn)行比較，最后對這兩個酶進(jìn)行協(xié)同作用研究。
　　 從NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)得到同源基因序列并設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)從E.cloacae中擴(kuò)增出大小為1.029 kb的內(nèi)切葡聚糖酶基因cel8A。構(gòu)建的表達(dá)載體pQE30-cel8A并轉(zhuǎn)入Escherichia coli XLl-blue(E.coliXL

3、l-blue)中進(jìn)行高效表達(dá)，重組子在羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板上有明顯水解圈。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，在37 kD處有明顯表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。通過NTA-Ni親和層析純化后，對cel8A重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定，其最適溫度為40℃，最適pH為7.0，Km值為46.95 mg/mL，Vmax值為0.38μmol/min，比活力為3.56 U/mg。
　　 同樣方法，從NCBI獲得同

4、源基因序列并設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)從B.licheniformis中擴(kuò)增出一段大小為2.1kb的外切葡聚糖酶cel48B基因片段。構(gòu)建表達(dá)載體pQE30-cel48B并轉(zhuǎn)入E.coli XLl-blue中進(jìn)行高效表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測，在77 kD處有明顯表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。通過NTA-Ni親和層析純化后，cel48B外切葡聚糖酶分別與底物纖維四糖和酸膨脹纖維素反應(yīng)，經(jīng)薄層層析(TLC)分析其主要產(chǎn)物為纖維二糖和葡萄糖，

5、證明了外切葡聚糖酶cel48B有外切葡聚糖酶活性。并對外切葡聚糖酶基因cel48B進(jìn)行了定點突變，確定了38、49、228為定點突變位點。利用反向PCR技術(shù)，獲得三個突變酶E38Q、E49Q和D228N，將其酶活與原始酶進(jìn)行比較，突變酶E38Q和D228N已經(jīng)沒有了外切葡聚糖酶活性，突變酶E49Q依然有外切葡聚糖酶活性。
　　 最后對內(nèi)切葡聚糖酶cel8A和外切葡聚糖酶cel48B協(xié)同作用研究。就目前實驗結(jié)果，兩者的協(xié)同作用小于