利用植物體內(nèi)引導(dǎo)RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因組編輯的研究.pdf

1、近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的靶向基因組編輯技術(shù)是一種能夠針對(duì)特定DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法。其主要方法是對(duì)目的基因進(jìn)行改造，進(jìn)而達(dá)到對(duì)未知功能基因研究的目的。精確的基因組編輯是一個(gè)為闡明基因功能和基因治療的功能強(qiáng)大工具。最近的DNA編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(ZNF)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)它們都是通過(guò)設(shè)計(jì)核酸酶與特異性識(shí)別結(jié)合DNA序列的蛋白融合而成，已經(jīng)在細(xì)胞系或者生物體中成功造成基因組的改變。ZNF和TALEN的方法都要求需要

2、兩套相反方向的與DNA重復(fù)結(jié)合的識(shí)別蛋白，其組裝過(guò)程非常繁瑣和耗費(fèi)大量時(shí)間。近期，一項(xiàng)由RNA介導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于特定基因組的改變，其系統(tǒng)是在天然細(xì)菌II型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的。與ZNF和TALEN相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)的DNA識(shí)別系統(tǒng)簡(jiǎn)單，是通過(guò)短的指導(dǎo) RNA來(lái)識(shí)別目的基因序列并與其互補(bǔ)。在CRISPR/ Cas系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)基因組編輯，其選擇目標(biāo)序列的選擇受限制于以G開始轉(zhuǎn)錄的U

3、6啟動(dòng)子，預(yù)留的20bp識(shí)別序列終止于Cas9核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)NGG。此外,最近的研究表明這個(gè)系統(tǒng),以及ZFN和TALEN,都可能產(chǎn)生不良的脫靶效應(yīng)。總的來(lái)說(shuō)，一種新的基因組編輯技術(shù)方法要求能夠人為可簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，對(duì)目的基因序列的選擇具有高度的靈活性并且能夠?qū)μ禺愋晕稽c(diǎn)進(jìn)行突變。GRATEN系統(tǒng)包含一條既能夠識(shí)別特異性序列又能夠被噬菌體外殼蛋白識(shí)別的嵌合 RNA，以及噬菌體外殼蛋白核酸內(nèi)切酶組成的融合蛋白構(gòu)成。我們?cè)谥参镏欣靡?/p>

4、導(dǎo)RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶(guided RNA and tethered endonuclease, GRATEN)用于基因組編輯，探究該套系統(tǒng)在植物基因組特異DNA序列位點(diǎn)達(dá)到突變的可行性。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為本式煙草葉，通過(guò)滲透注射煙草葉片，農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行了致使突變的探究。這些核糖核蛋白復(fù)合物有效地在本式煙草中破壞靶基因，其特點(diǎn)是能夠簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，對(duì)目標(biāo)序列的選擇沒(méi)有要求并且只對(duì)特異性位點(diǎn)進(jìn)行突變。探討利用該系統(tǒng)進(jìn)行DNA精確突變的

5、可能性，通過(guò)研究，建立一種簡(jiǎn)單、精確和高效的新型植物基因組編輯技術(shù)體系。
　　在本課題中我們做到一次性克隆多個(gè)基因，在“DNA洗牌技術(shù)”的幫助下，組裝了多個(gè)表達(dá)載體節(jié)省了大量時(shí)間和工作量。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以 GFP蛋白作為標(biāo)簽的定位表達(dá)載體，以此來(lái)研究克隆基因所表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的位置，分別在GFP的N和C端預(yù)留克隆位點(diǎn)，以克隆目的基因，完成構(gòu)建二種 GFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)表達(dá)載體。利用該基因克隆載體，將內(nèi)切酶 FokI的切割結(jié)構(gòu)域與 MS2

6、噬菌體外殼蛋白 MCP的串聯(lián)蛋白（FokI:MCP:FokI, FMF）分別克隆至GFP的N和C端，得到FMF與GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP，其中FMF的N端帶有細(xì)胞核定位信號(hào)。以本式氏煙草和洋蔥表皮為植物材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染植物瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察侵染的煙草細(xì)胞， GFP在細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)，并在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布,而帶有核定位的FMF:GFP和 GFP:FMF二種融合蛋白只在細(xì)胞核中觀察到熒光。