BCAS2在小鼠精子發(fā)生中的功能和機(jī)制研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個(gè)非常動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的過程，主要經(jīng)歷三個(gè)階段:精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變形，最終產(chǎn)生單倍體長(zhǎng)形精子。精子發(fā)生的每個(gè)階段都需要基因表達(dá)的精確調(diào)控?？勺兗艚幼鳛榉浅Ｖ匾幕蜣D(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，極大的增加了高等真核生物和復(fù)雜器官中轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的多樣性。大量研究數(shù)據(jù)顯示可變剪接調(diào)控了精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)和功能;此外，很多剪接因子在睪丸中呈現(xiàn)細(xì)胞或發(fā)育階段特異性表達(dá)模式，這都說明可變剪接可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重

2、要的調(diào)控功能。BCAS2(breast carcinoma amplifiedsequence2)是Prp19相關(guān)復(fù)合體的核心組分，參與了前體RNA的剪接等重要生命活動(dòng)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)BCAS2在雄性生殖細(xì)胞中具有特異性表達(dá)模式。本課題采用精原干細(xì)胞特異性敲除BCAS2的小鼠模型，研究BCAS2是否參與精子發(fā)生過程中的剪接。
　　通過對(duì)BCAS2在睪丸發(fā)育過程中的免疫染色觀察和生精細(xì)胞的富集，發(fā)現(xiàn)BCAS2在小鼠睪丸的精原干細(xì)

3、胞中相對(duì)高表達(dá)。Vasa-Cre介導(dǎo)生殖細(xì)胞特異性敲除BCAS2的雄性小鼠生長(zhǎng)正常，具有正常的交配行為，但不能生育后代;進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BCAS2缺失導(dǎo)致精子發(fā)生明顯異常，表現(xiàn)為減數(shù)第一次分裂前期的生殖細(xì)胞數(shù)目明顯下調(diào)，并且基本觀察不到減數(shù)分裂的關(guān)鍵事件（重組和聯(lián)會(huì)）。通過對(duì)精原干細(xì)胞的數(shù)量、定位、增殖和凋亡進(jìn)行染色和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，BCAS2缺失的睪丸中精原干細(xì)胞發(fā)育基本正常，但減數(shù)第一次分裂前期的精母細(xì)胞大量缺失，減數(shù)分裂啟動(dòng)的關(guān)鍵因子S

4、TRA8的表達(dá)也明顯下調(diào)，說明BCAS2缺失的睪丸無法正常啟動(dòng)減數(shù)分裂。為了進(jìn)一步解析BCAS2的作用機(jī)制，我們對(duì)出生后第9天(P9)的正常和BCAS2敲除的小鼠睪丸進(jìn)行了RNA深度測(cè)序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCAS2缺失的睪丸轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達(dá)基本正常。但是作為剪接目標(biāo)基因tubulin的表達(dá)明顯變化，提示BCAS2可能通過剪接發(fā)揮功能。為了研究BCAS2在pre-mRNA剪接方面的功能，我們進(jìn)一步研究了BCAS2缺失睪丸中的可變剪接的變化

5、。結(jié)果顯示，在BCAS2缺失的睪丸中有245個(gè)基因的可變剪接發(fā)生了異常，其中包括6個(gè)在精子發(fā)生中具有重要功能的基因（Dazl、Ehmt2、Hmga1、Cit、Hsf1和Bcl2l11）。利用半定量RT-PCR和real-time RT-PCR，我們成功驗(yàn)證出Dazl、Ehmt2和Hmga1的可變剪接異常。此外，BCAS2的缺失會(huì)導(dǎo)致“減數(shù)分裂促進(jìn)因子”DAZL不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)異常:全長(zhǎng)形式的轉(zhuǎn)錄本顯著性下調(diào)，而缺失8號(hào)外顯子的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)