Stra8在精子發(fā)生中作用機制的初步研究.pdf

1、Stra8基因是一個生殖腺特異性表達基因，其表達受到視黃酸(Retinoic acid，RA)的調控。Stra8基因敲除后雄性小鼠失去生育能力，精子發(fā)生阻滯在減數(shù)分裂階段，此過程中Stra8的作用機制尚未闡明。為了進一步探究Stra8在精子發(fā)生中的分子機制，本論文從以下三個部分展開了實驗研究。
　　第一部分:精子發(fā)生中Stra8下游作用基因及調控網絡的初步研究
　　目的:
　　探索Stra8在精子發(fā)生中的作用機制，找尋

2、其可能的下游作用基因，研究其下游調控網絡。
　　方法:
　　將Stra8.KO雜合型（Stra8+/-）小鼠合籠，收集子代純合型（Stra8-/-）和野生型（Stra8+/+）小鼠。取出生后5天～12天小鼠，制不同日齡睪丸組織切片，HE染色，觀察睪丸組織結構。用生精細胞標志物Ddx4對不同日齡小鼠睪丸組織行免疫組織化學熒光染色，并對陽性生精細胞進行計數(shù)及統(tǒng)計學分析。選取出生后11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組

3、織進行RNA-Sequnce，應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對RNA-Sequnce中表達有差異的基因進行驗證。
　　結果:
　　出生后不同日齡小鼠，5～11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織結構相似，單個生精小管內生精細胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計學差異。第12天時，Stra8+/+小鼠生精小管管腔內初級精母細胞與Stra8-/-小鼠相比明顯增多，且單個生精小管內生精細胞數(shù)量有顯著性差異。RNA-Sequnce

4、分析發(fā)現(xiàn)了96個RNA在Stra8敲除后表達量有顯著性差異，其中40個RNA表達下調，56個RNA表達上調。對其中21個基因進行qRT-PCR驗證，結果發(fā)現(xiàn)這些RNA的表達水平與RNA-Sequnce結果相一致。
　　結論:
　　應用RNA-Sequnce等實驗，發(fā)現(xiàn)了96個Stra8基因敲除后差異表達的RNA，其中21個基因可能參與精母細胞減數(shù)分裂、精原細胞自我更新及精原細胞分化等過程的調控。Stra8可能通過調控上述差異

5、表達基因，調節(jié)精子發(fā)生過程。
　　第二部分:兔抗小鼠Setd8多克隆抗體的制備
　　目的:
　　獲得小鼠Setd8原核蛋白，制備兔抗小鼠Setd8多克隆抗體。
　　方法:
　　將pGADT7-Setd8質粒和pET-30a載體分別雙限制性內切酶酶切后連接、轉化和鑒定，構建pET-30a-Setd8原核表達質粒。將pET-30a-Setd8質粒轉化到E.coli BL21中，用IPTG誘導蛋白表達，通過鎳親和

6、層析柱蛋白純化。用純化的Setd8蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得Setd8多克隆抗體。應用ELISA、Western blot及免疫組織化學法對Setd8多克隆抗體進行效價測定及特異性鑒定。
　　結果:
　　限制性內切酶雙酶切法及序列測定法表明:pET-30a-Setd8重組質粒構建成功。IPTG誘導后，大腸桿菌可高效表達Setd8原核蛋白。獲得的Setd8多克隆抗體經ELISA檢測，效價為1∶1000000。Western b

7、lot結果顯示:Setd8多克隆抗體能特異性識別細胞中的Setd8蛋白。免疫組織化學法顯示:Setd8主要表達在成年小鼠睪丸組織中的精原細胞。
　　結論:
　　成功獲得較高純度Setd8蛋白，制備的Setd8多克隆抗體具有較高反應性和特異性。
　　第三部分:成年小鼠睪丸內精原細胞及精母細胞的純化
　　目的:
　　建立一個簡便、高效的成年小鼠睪丸精原細胞、精母細胞純化方法。
　　方法:
　　運用酶

8、消化法將成年小鼠睪丸制備成單細胞懸液，經9層非連續(xù)Percoll密度梯度（17％、22％、25％、28％、31％、34％、37％、40％和90％）離心法分離，通過組織學染色和計數(shù)法確定精原細胞及精母細胞的純度。
　　結果:
　　酶消化后所得睪丸單細胞懸液經Percoll密度梯度離心，共形成9條細胞帶，其中22％密度梯度中主要為精子細胞;而31％、34％及37％密度梯度中主要為精原細胞及精母細胞，且純度較高，達71.50％。<