小分子化合物處理對川金絲猴-山羊異種核移植胚胎體外發(fā)育的影響.pdf

1、川金絲猴被列為國家一級瀕危野生保護(hù)動物，面臨現(xiàn)存數(shù)目的極劇下滑，如何優(yōu)化其在生長、發(fā)育及生殖繁育方面的問題引起了研究學(xué)者廣泛關(guān)注。由于物種珍貴且數(shù)量稀少，同種核移植受到一定限制，采用異種核移植的方法成功避免了這一問題。異種核移植的成功受核移植操作過程、受體細(xì)胞和供體細(xì)胞類型的影響，尤其是供體細(xì)胞重編程的能力，所以供體細(xì)胞的處理對異種核移植的成功起關(guān)鍵作用。隨著體細(xì)胞多潛能性研究的發(fā)展，運(yùn)用小分子化合物誘導(dǎo)處理對供體細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾

2、，提高重編程效率獲得了廣泛應(yīng)用。
　　本研究對川金絲猴來源的供體細(xì)胞用小分子化合物處理，以山羊卵母細(xì)胞為受體進(jìn)行異種核移植，探究處理前后對異種核移植胚胎體外發(fā)育的影響。本研究結(jié)果如下:
　　(1)研究材料為川金絲猴耳緣皮膚組織，采用組織塊貼壁法分離獲得耳緣皮膚成纖維細(xì)胞。用合適濃度的小分子化合物對獲得的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理，從細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、標(biāo)志性基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):分離得到川金絲猴耳緣皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)過數(shù)次

3、傳代培養(yǎng)仍能保持較高的活力;PCR顯示有胚外內(nèi)胚層標(biāo)志基因Sall4和Gata6的表達(dá);Q-PCR定量發(fā)現(xiàn)Gata6和Sall4的表達(dá)量升高。Gata6在2d、4d、12d的表達(dá)量升高顯著(p＜0.05)，尤其第6d和14d表達(dá)量升高極顯著(p＜0.01);Sall4表達(dá)量的升高更為明顯，在第2d、4d、10d表達(dá)量升高顯著(p＜0.05)，尤其第6d、8d、12d和14d表達(dá)量升高極顯著(p＜0.01)。
　　(2)兩者融合形成

4、重組異構(gòu)胚，激活后培養(yǎng)觀察胚胎的發(fā)育情況并統(tǒng)計各時期數(shù)量，Q-PCR和免疫熒光化學(xué)染色檢測早期發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)驗發(fā)現(xiàn):形成的川金絲猴-山羊重組異構(gòu)胚在發(fā)育各個階段處理組和對照組重構(gòu)胚數(shù)量無顯著差異(P＞0.05);相關(guān)標(biāo)志性基因檢測發(fā)現(xiàn):在處理組中Oct4、Prrx1的表達(dá)量顯著增加(p＜0.05)，且Sox2、Telemeras的表達(dá)量極顯著增加(p＜0.01)，相反Nanog的表達(dá)量降低但差異不顯著(p＞0.05);免疫熒光染